一种用于厚皮甜瓜杂交品种纯度鉴定的SSR引物组及其应用的制作方法

本发明属于厚皮甜瓜杂交种子纯度鉴定，尤其涉及一种用于厚皮甜瓜杂交品种纯度鉴定的ssr引物组及其应用。

背景技术：

1、种子纯度是衡量种子质量优劣的一项关键指标，甜瓜种子大多数为杂交种，在甜瓜杂交种繁殖过程中，由于去雄不彻底或花粉混杂污染、昆虫传粉等原因，使得杂交种纯度下降，种子纯度降低会显著降低作物的产量和产品品质，使农民蒙受巨大的经济损失，也制约产业的快速发展。因此，在制种后和销售前对甜瓜f1代杂种子进行纯度鉴定是必不可少的。

2、目前甜瓜杂交种纯度的鉴定多采用田间种植检验方法，不仅费工耗时，用地多，且容易受季节、环境因素影响，另外有些性状肉眼难以区分，从而降低鉴定结果的可靠性。随着分子生物学技术的快速发展，品种的纯度检测工作也深入到基因水平。ssr(simplesequence repeat)分子标记又称为微卫星dna标记，即简单序列重复，ssr分子标记具有重复性好、多态性高、共显性分离、操作简单等优点，可高效、准确区分父、母本及杂交种的带型，在茄子、葡萄、花生、甘薯、水稻、玉米、番茄等种子的纯度鉴定上得到广泛应用。

3、蜜语佳网、丰登蜜25、甬甜7号、银蜜58、丰登蜜1号、丰蜜29和甬甜5号是宁波市农业科学研究院蔬菜研究所自主选育的厚皮甜瓜杂交一代品种，具有高糖、高产、抗病性好等特色，深受甜瓜农户欢迎。目前需探索一种可以简单、快速、准确且不受季节气候限制的品种纯度鉴定方法。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供一种用于厚皮甜瓜杂交品种纯度鉴定的ssr引物组，所述引物组的具体核苷酸序列如seq id no.1-8所示。

2、优选地，所述核苷酸序列如seq id no.1-2所示的ssr1引物用于鉴定蜜语佳网的种子纯度；所述核苷酸序列如seq id no.3-4所示的ssr2引物用于鉴定丰登蜜25的种子纯度；所述核苷酸序列如seq id no.5-6所示的ssr3引物用于鉴定甬甜7号和银蜜58的种子纯度；所述核苷酸序列如seq id no.7-8所示的ssr4引物用于鉴定丰登蜜1号、丰蜜29和甬甜5号的种子纯度。

3、本发明地目的之二在于提供上述ssr引物组在鉴定厚皮甜瓜杂交品种纯度中的应用。

4、优选地，所述应用步骤为：

5、(1)从甜瓜种子的下胚轴中提取甜瓜基因组dna；

6、(2)以甜瓜基因组dna为模板，采用权利要求1中的引物进行pcr扩增，得扩增产物；

7、(3)将扩增产物利用琼脂糖凝胶电泳检测；

8、(4)对电泳结果进行分析，比较供试杂交种及其父母本的特征条带，当母本表现为1条特征条带，父本表现为相异于母本的1条特征条带，纯合的杂交种即表现为这2条特征条带的集合，则为真正杂交种，缺少其中任意一条条带的为假杂种。

9、更优选地，所述步骤(2)中pcr扩增采用的反应体系包括：浓度为100ng/μl的甜瓜基因组dna 1μl，10×pcr buffer 2.5μl，2.5mm的dntps 0.5μl，20μmol/l的正向引物0.5μl、 20μmol/l的反向引物0.5μl，2u taq dna聚合酶0.5μl，ddh2o补足至25μl。

10、更优选地，所述步骤(2)中pcr扩增程序为：94℃预变性5min后，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环后，72℃终延伸5min。

11、更优选地，所述甜瓜品种为蜜语佳网时，所述引物seq id no.1-2的pcr扩增产物含有大小为204bp和177bp的dna片段，则为真正杂交种，否则为假杂种；

12、所述甜瓜品种为丰登蜜25时，所述引物组seq id no.3-4的pcr扩增产物含有大小为 177bp和215bp的dna片段，则为真正杂交种，否则为假杂种；

13、所述甜瓜品种为甬甜7号时，所述引物seq id no.5-6的pcr扩增产物含有大小为232bp 和215bp的dna片段，则为真正杂交种，否则为假杂种。

14、所述甜瓜品种为银蜜58时，所述引物seq id no.5-6的pcr扩增产物含有大小为214bp 和237bp的dna片段，则为真正杂交种，否则为假杂种。

15、所述甜瓜品种为丰登蜜1号时，所述引物seq id no.7-8的pcr扩增产物含有大小为229 bp和117bp的dna片段，则为真正杂交种，否则为假杂种；

16、所述甜瓜品种为丰蜜29时，所述引物seq id no.7-8的pcr扩增产物含有大小为225bp和117bp的dna片段，则为真正杂交种，否则为假杂种；

17、所述甜瓜品种为甬甜5号时，所述引物seq id no.7-8的pcr扩增产物含有大小为117bp和252bp的dna片段，则为真正杂交种，否则为假杂种。

18、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

19、(1)本发明中的ssr引物组在蜜语佳网、丰登蜜25、甬甜7号、银蜜58、丰登蜜1号、丰蜜29和甬甜5号的杂种一代中能同时产生母本特异性标记和父本特异性标记，且特异性强；

20、(2)本发明方法可将厚皮甜瓜杂交种与其父母本区分开来，快速检测出杂交种子的纯度；

21、(3)本发明方法在种子催芽出2cm下胚轴时提取dna进行pcr扩增，就可以进行鉴定，具有准确、快速、成本低、鉴定周期短操作简便等优点，能够代替传统杂交种子纯度鉴定的方法，具有广阔的应用前景。

技术特征：

1.一种用于厚皮甜瓜杂交品种纯度鉴定的ssr引物组，其特征在于，所述引物组的具体核苷酸序列如seq id no.1-8所示。

2.根据权利要求1所述的ssr引物组，其特征在于，所述核苷酸序列如seq id no.1-2所示的ssr1引物用于鉴定蜜语佳网的种子纯度；所述核苷酸序列如seq id no.3-4所示的ssr2引物用于鉴定丰登蜜25的种子纯度；所述核苷酸序列如seq id no.5-6所示的ssr3引物用于鉴定甬甜7号和银蜜58的种子纯度；所述核苷酸序列如seq id no.7-8所示的ssr4引物用于鉴定丰登蜜1号、丰蜜29和甬甜5号的种子纯度。

3.权利要求2所述的ssr引物组在鉴定厚皮甜瓜杂交品种纯度中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用步骤为：

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中pcr扩增采用的反应体系包括：浓度为100ng/μl的甜瓜基因组dna 1μl，10×pcrbuffer 2.5μl，2.5mm的dntps 0.5μl，20μmol/l的正向引物0.5μl、20μmol/l的反向引物0.5μl，2u taq dna聚合酶0.5μl，ddh2o补足至25μl。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中pcr扩增程序为：94℃预变性5min后，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环后，72℃终延伸5min。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述甜瓜品种为蜜语佳网时，所述引物seqid no.1-2的pcr扩增产物含有大小为204bp和177bp的dna片段，则为真正杂交种，否则为假杂种；

技术总结
本发明公开了一种用于厚皮甜瓜杂交品种纯度鉴定的SSR引物组及其应用，属于厚皮甜瓜杂交种子纯度鉴定技术领域。所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑2所示的SSR1引物用于鉴定蜜语佳网的种子纯度；所述核苷酸序列如SEQ ID NO.3‑4所示的SSR2引物用于鉴定丰登蜜25的种子纯度；所述核苷酸序列如SEQ ID NO.5‑6所示的SSR3引物用于鉴定甬甜7号和银蜜58的种子纯度；所述核苷酸序列如SEQ ID NO.7‑8所示的SSR4引物用于鉴定丰登蜜1号、丰蜜29和甬甜5号的种子纯度。本发明提供的甜瓜纯度鉴定方法大大缩短了鉴定时间，节省了鉴定成本，提高了鉴定准确度。

技术研发人员：郝芳敏,臧全宇,丁伟红,马二磊,黄芸萍,王毓洪
受保护的技术使用者：宁波市农业科学研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13