抗CTLA-4结合蛋白和其使用方法与流程

本文提供了对ctla-4具有结合特异性的抗原结合蛋白(abp)和包括此类abp的组合物，包含药物组合物、诊断组合物和试剂盒。还提供了制备ctla-4 abp的方法，以及使用ctla-4 abp的方法，例如，用于治疗目的、诊断目的和研究目的。

背景技术：

1、ctla-4，也被称为细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4和cd152(分化簇152)，是一种抑制t细胞炎性活性的细胞表面受体。ctla-4由调节性t细胞(treg)组成性地表达，并在受刺激的t细胞中上调。也在如树突状细胞(dc)等抗原呈递细胞(apc)中表达的cd80和cd86是ctla-4的主要配体。ctla-4和其配体之间的相互作用对于下调免疫应答和通过抑制t细胞炎性活性促进自身耐受至关重要。这种活性可以预防自身免疫性疾病，以及防止免疫系统杀死癌细胞。

2、ctla-4是免疫球蛋白超家族的成员，其由激活的t细胞表达并向t细胞传递抑制信号。ctla-4以比cd28更大的亲和力和亲合力结合cd80和cd86，从而使其能够在其配体方面胜过cd28。ctla-4向t细胞传递抑制信号，而cd28传递刺激信号。ctla-4也存在于调节性t细胞(treg)中并且有助于其抑制功能。通过t细胞受体和cd28激活t细胞使ctla-4的表达增加。ctla-4在t细胞中的作用机制仍有争议。生化证据表明，ctla-4向t细胞受体(tcr)募集磷酸酶，从而减弱信号。这项工作自首次公布以来一直未在文献中得到证实。最近的工作表明，ctla-4可以通过从抗原呈递细胞的膜上捕获和去除b7-1和b7-2，从而使其无法触发cd28来在体内发挥作用。

3、ctla-4中的变体与胰岛素依赖型糖尿病、格雷夫斯氏病(graves'disease)、桥本氏甲状腺炎(hashimoto's thyroiditis)、乳糜泻、系统性红斑狼疮、甲状腺相关眼眶病、原发性胆汁性肝硬化和其它自身免疫性疾病相关。ctla-4对cd80和cd86的相对较高的结合亲和力使其成为自身免疫性疾病的潜在疗法。ctla-4和抗体(ctla-4-ig)的可溶性融合蛋白已用于类风湿性关节炎的临床试验。

4、最近，ctla-4抗体已被用于治疗某些类型的癌症，并取得了不同程度的成功。ctla-4抑制剂已被证明可以拮抗ctla-4与其配体的结合，由此激活免疫系统来攻击肿瘤。目前已知的抗ctla-4疗法的作用机制是阻断ctla-4与其配体之间的相互作用以抑制检查点。例如，ctla-4单克隆抗体(mab)，如伊匹单抗(ipilimumab)，最初旨在阻断ctla-4与其配体b7蛋白cd80和cd86的结合，即“检查点抑制”。阻断ctla-4与b7蛋白的结合释放b7蛋白与cd28结合，从而诱导t细胞共刺激和激活。ctla-4抗体也已被用于诱导对肿瘤微环境具有特异性的treg的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)，从而降低对肿瘤的免疫耐受性。因此，除了阻断ctla-4与其b7配体的相互作用外，抗ctla-4 mab还能够诱导表达相对高水平的表面ctla-4的肿瘤内foxp3+调节性t细胞(treg)的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)和抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)。

5、因此，抑制ctla-4功能是目前对多种疾病最有希望的全身疗法之一。需要开发可以用于治疗、诊断和研究各种疾病(包含癌症和自身免疫性疾病)的ctla-4 abp。

6、于2019年12月27日提交并公布为公开第wo2020140084a1的pct申请pct/us2019/068820描述了ctla-4 abp，所述pct申请通过引用整体并入本文。

技术实现思路

1、本文提供了对ctla-4具有结合特异性的新型abp以及使用此类abp的方法。所述abp与人ctla-4(seq id:7001)或人ctla-4的片段特异性结合。

2、具体地，一方面，本公开提供了一种新型ctla-4单克隆抗体，其阻断ctla-4与其cd80/cd86配体结合的能力极小，但具有优异的抗肿瘤活性和降低的毒性。抗ctla4抗体被证明在表达人ctla-4的小鼠模型中诱导较少的外周treg增殖和更有效的瘤内treg耗尽。

3、本公开还提供了抗ctla-4单克隆抗体在不同于其它已知抗ctla-4抗体(例如，伊匹单抗)的表位处与ctla-4结合，并且具有有限的检查点抑制剂活性，并且因此是弱检查点抑制剂。令人惊讶的是，发现本文所提供的抗ctla-4抗体的功效与肿瘤微环境中fcr介导的treg耗尽相关。抗ctla-4抗体还诱导较少的treg增殖，并且增加了诱导体外fcr信号传导和体内肿瘤内treg耗尽的能力。本文所描述的实验结果表明，弱检查点抑制剂的增强的fcr活性可能有助于其增强的抗肿瘤活性。所述实验结果还表明，弱检查点抑制与鼠类模型中的较低毒性相关。

4、在一些实施例中，当与ctla-4结合时，abp接触氨基酸k130、y139、l141、i143，但不接触ctla-4的氨基酸r70，或者r70在能量上不是ctla-4与abp之间相互作用的主要贡献者；和/或当与abp结合时，ctla-4可以与cd80/cd86缔合；和/或abp与ctla-4的氨基酸l74a和/或e68之间的相互作用大于伊匹单抗与ctla-4的氨基酸l74a之间的相互作用。

5、在一些实施例中，所述abp包括由seq id no:12078或seq id no:1014组成的cdr1-l、由seq id no:12079或seq id no:2014组成的cdr2-l、由seq id no:12080或seqid no:3014组成的cdr3-l、由seq id no:12075或seq id no:4014组成的cdr1-h、由seq idno:12076或seq id no:5014组成的cdr2-h以及由seq id no:12077或seq id no:6014组成的cdr3-h。在一些实施例中，所述abp包括由seq id no:12004组成的cdr1-l、由seq id no:12014组成的cdr2-l、由seq id no:12024组成的cdr3-l、由seq id no:12039组成的cdr1-h、由seq id no:12049组成的cdr2-h以及由seq id no:12059组成的cdr3-h。在一些实施例中，所述abp包括由seq id no:12005组成的cdr1-l、由seq id no:12015组成的cdr2-l、由seq id no:12025组成的cdr3-l、由seq id no:12040组成的cdr1-h、由seq id no:12050组成的cdr2-h以及由seq id no:12060组成的cdr3-h。在一些实施例中，所述abp包括由seqid no:12006组成的cdr1-l、由seq id no:12016组成的cdr2-l、由seq id no:12026组成的cdr3-l、由seq id no:12041组成的cdr1-h、由seq id no:12051组成的cdr2-h以及由seqid no:12061组成的cdr3-h。在一些实施例中，所述abp包括由seq id no:12007组成的cdr1-l、由seq id no:12017组成的cdr2-l、由seq id no:12027组成的cdr3-l、由seq idno:12042组成的cdr1-h、由seq id no:12052组成的cdr2-h以及由seq id no:12062组成的cdr3-h。在一些实施例中，所述abp包括由seq id no:12008组成的cdr1-l、由seq id no:12018组成的cdr2-l、由seq id no:12028组成的cdr3-l、由seq id no:12043组成的cdr1-h、由seq id no:12053组成的cdr2-h以及由seq id no:12063组成的cdr3-h。

6、在一些实施例中，所述abp包括可变轻链(vl)和可变重链(vh)，所述vl包括与seqid no:14至少97％相同的序列，所述vh包括与seq id no:114至少97％相同的序列。

7、在一些实施例中，所述abp包括scfv或全长单克隆抗体。在一些实施例中，所述abp包括免疫球蛋白恒定区。

8、在一些实施例中，所述abp以小于500nm的kd与人ctla-4结合，如通过表面等离子共振所测量的；或者所述abp以小于200nm的kd与人ctla-4结合，如通过表面等离子共振所测量的；或者所述abp以小于25nm的kd与人ctla-4结合，如通过表面等离子共振测得的；或者所述abp以小于25nm的kd与细胞表面上的人ctla-4结合。

9、在一些实施例中，所述abp是igg1 abp。在一些实施例中，所述abp包括ighg1*01人重链恒定区基因片段。在一些实施例中，所述abp包括在根据imgt外显子编号的氨基酸位置97(r97)处的赖氨酸。在一些实施例中，所述abp包括在根据eu编号的氨基酸位置97(r214)处的赖氨酸。

10、在一些实施例中，所述abp包括去岩藻糖基化的fc区。

11、在一些实施例中，所述abp由包括细菌蛋白rmd(gdp-6-脱氧-d-来苏-4-己酮糖还原酶)或其修饰的细胞产生。在一些实施例中，所述细胞在不存在岩藻糖的情况下培养。

12、在一些实施例中，所述abp由缺少fut8或减少的fut8的表达的细胞产生。在一些实施例中，所述abp由在存在岩藻糖基化抑制剂2-氟岩藻糖(2ff)的情况下培养的细胞产生。在一些实施例中，所述abp由过表达糖基转移酶(gntiii)的细胞产生。在一些实施例中，所述abp已基于其岩藻糖基化状态分离。

13、在一些实施例中，所述abp包括fc区，所述fc区缺少fc部分的n-聚糖的核心岩藻糖基化。在一些实施例中，所述abp是去岩藻糖基化的单克隆抗体。

14、本公开的各方面还包含一种药物组合物，其包括本公开的abp以及药学上可接受的赋形剂。

15、在一些实施例中，少于50％的所述abp是岩藻糖基化的。在一些实施例中，少于40％的所述abp是岩藻糖基化的。在一些实施例中，少于30％的所述abp是岩藻糖基化的。在一些实施例中，少于20％的所述abp是岩藻糖基化的。在一些实施例中，少于10％的所述abp是岩藻糖基化的。在一些实施例中，多于30％的所述abp是岩藻糖基化的。在一些实施例中，多于40％的所述abp是岩藻糖基化的。在一些实施例中，多于50％的所述abp是岩藻糖基化的。在一些实施例中，多于60％的所述abp是岩藻糖基化的。在一些实施例中，多于70％的所述abp是岩藻糖基化的。在一些实施例中，多于80％的所述abp是岩藻糖基化的。在一些实施例中，多于90％的所述abp是岩藻糖基化的。

16、在一些实施例中，所述药物组合物的ph为5.0至6.5。在一些实施例中，所述药物组合物包括20mm的组氨酸或柠檬酸盐缓冲液。在一些实施例中，所述药物组合物包括50mm的nacl。在一些实施例中，所述药物组合物包括浓度为170mm至270mm的蔗糖。在一些实施例中，所述药物组合物包括170mm或270mm的蔗糖。在一些实施例中，所述药物组合物包括5mg/ml至20mg/ml的所述abp。在一些实施例中，所述药物组合物包括20mg/ml的所述abp。在一些实施例中，所述药物组合物包括5mg/ml的所述abp。

17、本公开的各方面提供了一种治疗疾病的方法，所述方法包括以下步骤：向有需要的受试者施用有效量的本公开的abp中的任何一种abp中的abp或其药物组合物。

18、在一些实施例中，所述疾病选自由以下组成的组：癌症、aids、阿尔茨海默氏病(alzheimer's disease)和病毒或细菌感染。

19、在一些实施例中，进一步包括向所述受试者施用一种或多种另外的治疗剂的步骤。在一些实施例中，另外的治疗剂选自抗pd-l1、抗pd1、lag-3抑制剂、cd47抑制剂、tigit抑制剂、化疗剂、免疫刺激剂、放射、braf抑制剂、mek抑制剂、pi3k抑制剂、细胞因子、编码细胞因子的多核苷酸、编码细胞因子的溶瘤病毒及其组合。

20、本公开的各方面包含一种分离的多核苷酸，其编码所述abp。本公开的各方面包含一种载体，其包括所述分离的多核苷酸。本公开的各方面提供了一种宿主细胞，其包括本公开的所述分离的多核苷酸或所述载体。在一些实施例中，所述宿主细胞进一步包括细菌蛋白rmd(gdp-6-脱氧-d-来苏-4-己酮糖还原酶)。在一些实施例中，所述宿主细胞在不存在岩藻糖的情况下培养。在一些实施例中，所述宿主细胞缺少fut8或具有减少的fut8的表达。在一些实施例中，所述宿主细胞在存在岩藻糖基化抑制剂2-氟岩藻糖(2ff)的情况下培养。在一些实施例中，所述宿主细胞过表达糖基转移酶(gntiii)。

21、本公开的各方面提供了一种产生与人ctla-4特异性结合的分离的抗原结合蛋白(abp)的方法，所述方法包括：诱导所述abp在本公开的所述宿主细胞中的表达；以及分离所述abp。

22、在一些实施例中，进一步包括基于所述abp的岩藻糖基化状态分离所述abp的步骤。在一些实施例中，所述宿主细胞在包括岩藻糖基化抑制剂的培养基中培养。在一些实施例中，所述岩藻糖基化抑制剂是2-氟岩藻糖(2ff)。

23、一种减少受试者的ctla-4hi treg的方法，所述受试者具有有限的剩余treg的增殖，所述方法包括施用有效剂量的本公开所描述的abp或药物组合物。

24、在一些实施例中，所述受试者是人类受试者，任选地是患有rcc(肾细胞癌)、nsclc(非小细胞肺癌)、默克尔细胞癌(merkel cell carcinoma)、cscc、间皮瘤、msi结直肠癌、卵巢癌或宫颈癌的人类受试者。

25、在一些实施例中，进一步包括向所述受试者施用一种或多种另外的治疗剂的步骤。在一些实施例中，所述另外的治疗剂是抗pd-l1或抗pd1或其组合。

26、另一方面，本公开提供了一种分离的抗原结合蛋白(abp)，其与人细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla-4)特异性结合，其中所述abp包括：(a)由seq id no:12078组成的cdr1-l、由seq id no:12079组成的cdr2-l、由seq id no:12080组成的cdr3-l、由seq idno:12075组成的cdr1-h、由seq id no:12076组成的cdr2-h以及由seq id no:12077组成的cdr3-h；(b)由seq id no:1014组成的cdr1-l、由seq id no:2014组成的cdr2-l、由seq idno:3014组成的cdr3-l、由seq id no:4014组成的cdr1-h、由seq id no:5014组成的cdr2-h以及由seq id no:6014组成的cdr3-h；(c)由seq id no:12004组成的cdr1-l、由seq idno:12014组成的cdr2-l、由seq id no:12024组成的cdr3-l、由seq id no:12039组成的cdr1-h、由seq id no:12049组成的cdr2-h以及由seq id no:12059组成的cdr3-h；(d)由seq id no:12005组成的cdr1-l、由seq id no:12015组成的cdr2-l、由seq id no:12025组成的cdr3-l、由seq id no:12040组成的cdr1-h、由seq id no:12050组成的cdr2-h以及由seq id no:12060组成的cdr3-h；(e)由seq id no:12006组成的cdr1-l、由seq id no:12016组成的cdr2-l、由seq id no:12026组成的cdr3-l、由seq id no:12041组成的cdr1-h、由seq id no:12051组成的cdr2-h以及由seq id no:12061组成的cdr3-h；(f)由seq idno:12007组成的cdr1-l、由seq id no:12017组成的cdr2-l、由seq id no:12027组成的cdr3-l、由seq id no:12042组成的cdr1-h、由seq id no:12052组成的cdr2-h以及由seqid no:12062组成的cdr3-h；或(g)由seq id no:12008组成的cdr1-l、由seq id no:12018组成的cdr2-l、由seq id no:12028组成的cdr3-l、由seq id no:12043组成的cdr1-h、由seq id no:12053组成的cdr2-h以及由seq id no:12063组成的cdr3-h。

27、在一些实施例中，所述abp包括可变轻链(vl)和可变重链(vh)，所述vl包括与seqid no:14至少97％相同的序列，所述vh包括与seq id no:114至少97％相同的序列。

28、在一些实施例中，所述abp包括scfv或全长单克隆抗体。在一些实施例中，所述abp包括免疫球蛋白恒定区。

29、在一些实施例中，所述abp以小于500nm的kd与人ctla-4结合，如通过表面等离子共振所测量的；或者所述abp以小于200nm的kd与人ctla-4结合，如通过表面等离子共振所测量的；或者所述abp以小于25nm的kd与人ctla-4结合，如通过表面等离子共振测得的；或者所述abp以小于25nm的kd与细胞表面上的人ctla-4结合。

30、在一些实施例中，所述abp是igg1 abp。在一些实施例中，所述abp包括ighg1*01人重链恒定区基因片段。在一些实施例中，所述abp包括在根据imgt外显子编号的氨基酸位置97(r97)处的赖氨酸。在一些实施例中，所述abp包括在根据eu编号的氨基酸位置97(r214)处的赖氨酸。

31、在一些实施例中，所述abp包括去岩藻糖基化的fc区。

32、在一些实施例中，所述abp由包括细菌蛋白rmd(gdp-6-脱氧-d-来苏-4-己酮糖还原酶)或其修饰的细胞产生。在一些实施例中，所述细胞在不存在岩藻糖的情况下培养。在一些实施例中，所述abp由缺少fut8或减少的fut8的表达的细胞产生。在一些实施例中，所述abp由在存在岩藻糖基化抑制剂2-氟岩藻糖(2ff)的情况下培养的细胞产生。在一些实施例中，所述abp由过表达糖基转移酶(gntiii)的细胞产生。在一些实施例中，所述abp已基于其岩藻糖基化状态分离。

33、在一些实施例中，所述的abp包括fc区，所述fc区缺少fc部分的n-聚糖的核心岩藻糖基化。在一些实施例中，所述abp是去岩藻糖基化的单克隆抗体。在一些实施例中，所述去岩藻糖基化的fc区具有少于30％的岩藻糖基化，并且其中少于30％的岩藻糖基化增强fcgriii(fcγ受体iii)信号传导。在一些实施例中，所述去岩藻糖基化的fc区具有少于30％的岩藻糖基化，并且其中少于30％的岩藻糖基化增强fcgriiia(fcγ受体iiia)信号传导。在一些实施例中，所述去岩藻糖基化的fc区具有少于30％的岩藻糖基化，并且其中少于30％的岩藻糖基化增强由fcgr3a编码的蛋白质编码的蛋白质。

34、本公开的各方面包含一种药物组合物，其包括本公开的abp以及药学上可接受的赋形剂。

35、在一些实施例中，少于50％的所述abp是岩藻糖基化的。在一些实施例中，少于40％的所述abp是岩藻糖基化的。在一些实施例中，少于30％的所述abp是岩藻糖基化的。在一些实施例中，少于20％的所述abp是岩藻糖基化的。在一些实施例中，少于10％的所述abp是岩藻糖基化的。在一些实施例中，多于30％的所述abp是岩藻糖基化的。在一些实施例中，多于40％的所述abp是岩藻糖基化的。在一些实施例中，多于50％的所述abp是岩藻糖基化的。在一些实施例中，多于60％的所述abp是岩藻糖基化的。在一些实施例中，多于70％的所述abp是岩藻糖基化的。在一些实施例中，多于80％的所述abp是岩藻糖基化的。在一些实施例中，多于90％的所述abp是岩藻糖基化的。

36、在一些实施例中，所述药物组合物的ph为5.0至6.5。在一些实施例中，所述药物组合物包括20mm的组氨酸或柠檬酸盐缓冲液。在一些实施例中，所述药物组合物包括50mm的nacl。在一些实施例中，所述药物组合物包括浓度为170mm至270mm的蔗糖。在一些实施例中，所述药物组合物包括170mm或270mm的蔗糖。在一些实施例中，所述药物组合物包括5mg/ml至20mg/ml的所述abp。在一些实施例中，所述药物组合物包括20mg/ml的所述abp。在一些实施例中，所述药物组合物包括5mg/ml的所述abp。

37、本公开的各方面提供了一种治疗疾病的方法，所述方法包括以下步骤：向有需要的受试者施用有效量的本公开的abp中的任何一种abp中的abp或其药物组合物。

38、在一些实施例中，所述疾病选自由以下组成的组：癌症、aids、阿尔茨海默氏病和病毒或细菌感染。

39、在一些实施例中，进一步包括向所述受试者施用一种或多种另外的治疗剂的步骤。在一些实施例中，另外的治疗剂选自抗pd-l1、抗pd1、lag-3抑制剂、cd47抑制剂、tigit抑制剂、化疗剂、免疫刺激剂、放射、braf抑制剂、mek抑制剂、pi3k抑制剂、细胞因子、编码细胞因子的多核苷酸、编码细胞因子的溶瘤病毒及其组合。

40、本公开的各方面包含一种分离的多核苷酸，其编码所述abp。本公开的各方面包含一种载体，其包括所述分离的多核苷酸。本公开的各方面提供了一种宿主细胞，其包括本公开的所述分离的多核苷酸或所述载体。在一些实施例中，所述宿主细胞进一步包括细菌蛋白rmd(gdp-6-脱氧-d-来苏-4-己酮糖还原酶)。在一些实施例中，所述宿主细胞在不存在岩藻糖的情况下培养。在一些实施例中，所述宿主细胞缺少fut8或具有减少的fut8的表达。在一些实施例中，所述宿主细胞在存在岩藻糖基化抑制剂2-氟岩藻糖(2ff)的情况下培养。在一些实施例中，所述宿主细胞过表达糖基转移酶(gntiii)。

41、本公开的各方面提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括以下步骤：向有需要的受试者施用有效量的本公开的abp或药物组合物。在一些实施例中，所述受试者患有恶性肿瘤。在一些实施例中，当被施用时，与伊匹单抗相比，所述abp包括增加的fc受体(fcr)信号传导，并且其中所述施用减少所述受试者的ctla-4hi treg的量。在一些实施例中，与伊匹单抗相比，所述施用减少所述受试者的外周treg的增殖。

42、在一些实施例中，进一步包括向所述受试者施用一种或多种另外的治疗剂的步骤。在一些实施例中，所述另外的治疗剂选自抗pd-l1、抗pd1、tigit抑制剂、lag-3抑制剂、cd47抑制剂、braf抑制剂、mek抑制剂、pi3k抑制剂、化疗剂、免疫刺激剂、放射、细胞因子、编码细胞因子的多核苷酸、编码细胞因子的溶瘤病毒及其组合。

43、在一些实施例中，所述abp包括具有少于30％的岩藻糖基化的去岩藻糖基化的fc区，并且其中少于30％的岩藻糖基化增强fcgriii信号传导。在一些实施例中，所述abp包括具有少于30％的岩藻糖基化的去岩藻糖基化的fc区，并且其中少于30％的岩藻糖基化增强fcgriiia信号传导。在一些实施例中，所述abp包括包括具有多于70％的岩藻糖基化的岩藻糖基化的fc区。在一些实施例中，所述去岩藻糖基化的fc区具有少于30％的岩藻糖基化，并且其中少于30％的岩藻糖基化增强由fcgr3a编码的蛋白质编码的蛋白质。

44、本公开的各方面包含一种分离的多核苷酸，其编码所述abp。本公开的各方面包含一种载体，其包括所述分离的多核苷酸。本公开的各方面提供了一种宿主细胞，其包括本公开的所述分离的多核苷酸或所述载体。在一些实施例中，所述宿主细胞进一步包括细菌蛋白rmd(gdp-6-脱氧-d-来苏-4-己酮糖还原酶)。在一些实施例中，所述宿主细胞在不存在岩藻糖的情况下培养。在一些实施例中，所述宿主细胞缺少fut8或具有减少的fut8的表达。在一些实施例中，所述宿主细胞在存在岩藻糖基化抑制剂2-氟岩藻糖(2ff)的情况下培养。在一些实施例中，所述宿主细胞过表达糖基转移酶(gntiii)。

45、本公开的各方面提供了一种产生与人ctla-4特异性结合的分离的抗原结合蛋白(abp)的方法，所述方法包括：诱导所述abp在本公开的宿主细胞中的表达；以及分离所述abp，其中所述abp包括去岩藻糖基化的fc。

46、在一些实施例中，进一步包括基于所述abp的岩藻糖基化状态分离所述abp的步骤。在一些实施例中，所述宿主细胞在包括岩藻糖基化抑制剂的培养基中培养。在一些实施例中，所述岩藻糖基化抑制剂是2-氟岩藻糖(2ff)。

47、另一方面，本公开提供了一种分离的抗原结合蛋白(abp)，其与人细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla-4)特异性结合，所述abp包括ighg1*01人重链恒定区基因片段。

48、在一些实施例中，所述abp包括：(a)由seq id no:12078组成的cdr1-l、由seq idno:12079组成的cdr2-l、由seq id no:12080组成的cdr3-l、由seq id no:12075组成的cdr1-h、由seq id no:12076组成的cdr2-h以及由seq id no:12077组成的cdr3-h；(b)由seq id no:1014组成的cdr1-l、由seq id no:2014组成的cdr2-l、由seq id no:3014组成的cdr3-l、由seq id no:4014组成的cdr1-h、由seq id no:5014组成的cdr2-h以及由seqid no:6014组成的cdr3-h；(c)由seq id no:12004组成的cdr1-l、由seq id no:12014组成的cdr2-l、由seq id no:12024组成的cdr3-l、由seq id no:12039组成的cdr1-h、由seq idno:12049组成的cdr2-h以及由seq id no:12059组成的cdr3-h；(d)由seq id no:12005组成的cdr1-l、由seq id no:12015组成的cdr2-l、由seq id no:12025组成的cdr3-l、由seqid no:12040组成的cdr1-h、由seq id no:12050组成的cdr2-h以及由seq id no:12060组成的cdr3-h；(e)由seq id no:12006组成的cdr1-l、由seq id no:12016组成的cdr2-l、由seq id no:12026组成的cdr3-l、由seq id no:12041组成的cdr1-h、由seq id no:12051组成的cdr2-h以及由seq id no:12061组成的cdr3-h；(f)由seq id no:12007组成的cdr1-l、由seq id no:12017组成的cdr2-l、由seq id no:12027组成的cdr3-l、由seq id no:12042组成的cdr1-h、由seq id no:12052组成的cdr2-h以及由seq id no:12062组成的cdr3-h；或(g)由seq id no:12008组成的cdr1-l、由seq id no:12018组成的cdr2-l、由seq id no:12028组成的cdr3-l、由seq id no:12043组成的cdr1-h、由seq id no:12053组成的cdr2-h以及由seq id no:12063组成的cdr3-h。在一些实施例中，所述abp包括可变轻链(vl)和可变重链(vh)，所述vl包括与seq id no:14至少97％相同的序列，所述vh包括与seq id no:114至少97％相同的序列。

49、在一些实施例中，所述abp包括：(a)由seq id no:中任何一个组成的cdr1-l、由seq id no:1001-1028中任何一个组成的cdr2-l、由seq id no:2001-2028中任何一个组成的cdr3-l、由seq id no:中任何一个组成的cdr1-h、由seq id no:3001-3028中任何一个组成组成的cdr2-h。在一些实施例中，所述abp包括可变轻链(vl)和可变重链(vh)，所述vl包括与seq id no:1-28中任何一个至少97％相同的序列，所述vh包括与seq id no:1-128至少97％相同的序列。

50、在一些实施例中，所述abp包括在根据imgt外显子编号的氨基酸位置97(r97)处的赖氨酸。在一些实施例中，所述abp包括在根据eu编号的氨基酸位置97(r214)处的赖氨酸。在一些实施例中，包括去岩藻糖基化的fc区。在一些实施例中，由包括细菌蛋白rmd(gdp-6-脱氧-d-来苏-4-己酮糖还原酶)或其修饰的细胞产生。在一些实施例中，所述细胞在不存在岩藻糖的情况下培养。在一些实施例中，由缺少fut8或减少的fut8的表达的细胞产生。在一些实施例中，由在存在岩藻糖基化抑制剂2-氟岩藻糖(2ff)的情况下培养的细胞产生。在一些实施例中，由过表达糖基转移酶(gntiii)的细胞产生。在一些实施例中，已基于其岩藻糖基化状态分离。在一些实施例中，包括fc区，所述fc区缺少fc部分的n-聚糖的核心岩藻糖基化。在一些实施例中，所述abp是去岩藻糖基化的单克隆抗体。

51、本公开的各方面包含一种药物组合物，其包括本公开的abp以及药学上可接受的赋形剂。

52、在一些实施例中，少于50％的所述abp是岩藻糖基化的。在一些实施例中，少于40％的所述abp是岩藻糖基化的。在一些实施例中，少于30％的所述abp是岩藻糖基化的。在一些实施例中，少于20％的所述abp是岩藻糖基化的。在一些实施例中，少于10％的所述abp是岩藻糖基化的。在一些实施例中，多于30％的所述abp是岩藻糖基化的。在一些实施例中，多于40％的所述abp是岩藻糖基化的。在一些实施例中，多于50％的所述abp是岩藻糖基化的。在一些实施例中，多于60％的所述abp是岩藻糖基化的。在一些实施例中，多于70％的所述abp是岩藻糖基化的。在一些实施例中，多于80％的所述abp是岩藻糖基化的。在一些实施例中，多于90％的所述abp是岩藻糖基化的。

53、在一些实施例中，所述药物组合物的ph为5.0至6.5。在一些实施例中，所述药物组合物包括20mm的组氨酸或柠檬酸盐缓冲液。在一些实施例中，所述药物组合物包括50mm的nacl。在一些实施例中，所述药物组合物包括浓度为170mm至270mm的蔗糖。在一些实施例中，所述药物组合物包括170mm或270mm的蔗糖。在一些实施例中，所述药物组合物包括5mg/ml至20mg/ml的所述abp。在一些实施例中，所述药物组合物包括20mg/ml的所述abp。在一些实施例中，所述药物组合物包括5mg/ml的所述abp。

54、本公开的各方面提供了一种治疗疾病的方法，所述方法包括以下步骤：向有需要的受试者施用有效量的所述abp或所述药物组合物。

55、在一些实施例中，所述疾病选自由以下组成的组：癌症、aids、阿尔茨海默氏病和病毒或细菌感染。

56、在一些实施例中，进一步包括向所述受试者施用一种或多种另外的治疗剂的步骤。在一些实施例中，所述另外的治疗剂选自抗pd-l1、抗pd1、tigit抑制剂、lag-3抑制剂、cd47抑制剂、braf抑制剂、mek抑制剂、pi3k抑制剂、化疗剂、免疫刺激剂、放射、细胞因子、编码细胞因子的多核苷酸、编码细胞因子的溶瘤病毒及其组合。

57、本公开的各方面包含一种分离的多核苷酸，其编码所述abp。本公开的各方面包含一种载体，其包括所述分离的多核苷酸。本公开的各方面提供了一种宿主细胞，其包括本公开的所述分离的多核苷酸或所述载体。在一些实施例中，所述宿主细胞进一步包括细菌蛋白rmd(gdp-6-脱氧-d-来苏-4-己酮糖还原酶)。在一些实施例中，所述宿主细胞在不存在岩藻糖的情况下培养。在一些实施例中，所述宿主细胞缺少fut8或具有减少的fut8的表达。在一些实施例中，所述宿主细胞在存在岩藻糖基化抑制剂2-氟岩藻糖(2ff)的情况下培养。在一些实施例中，所述宿主细胞过表达糖基转移酶(gntiii)。

58、本公开的各方面提供了一种产生与人ctla-4特异性结合的分离的抗原结合蛋白(abp)的方法，所述方法包括：诱导所述abp在所述宿主细胞中的表达；以及分离所述abp。

59、在一些实施例中，进一步包括基于所述abp的岩藻糖基化状态分离所述abp的步骤。在一些实施例中，所述宿主细胞在包括岩藻糖基化抑制剂的培养基中培养。在一些实施例中，所述岩藻糖基化抑制剂是2-氟岩藻糖(2ff)。

60、本公开的各方面提供了一种减少受试者的ctla-4hi treg的方法，所述受试者具有有限的剩余treg的增殖，所述方法包括施用有效剂量的所述abp或所述药物组合物。

61、在一些实施例中，所述受试者是人类受试者，任选地是患有黑色素瘤、rcc(肾细胞癌)、nsclc(非小细胞肺癌)、默克尔细胞癌、cscc、间皮瘤、msi结直肠癌、卵巢癌或宫颈癌的人类受试者。在一些实施例中，进一步包括向所述受试者施用一种或多种另外的治疗剂的步骤。在一些实施例中，所述另外的治疗剂是抗pd-l1或抗pd1或其组合。在一些实施例中，所述受试者患有具有高水平的treg、高水平的ctla-4、高水平的nk细胞或高水平的激活fcr的肿瘤。

62、另一方面，本公开提供了一种分离的抗原结合蛋白(abp)，其与抗原特异性结合，所述abp包括ighg1*01人重链恒定区基因片段。

63、在一些实施例中，所述abp包括在根据imgt外显子编号的氨基酸位置97(r97)处的赖氨酸。在一些实施例中，所述abp包括在根据eu编号的氨基酸位置97(r214)处的赖氨酸。

64、在一些实施例中，包括去岩藻糖基化的fc区。在一些实施例中，由包括细菌蛋白rmd(gdp-6-脱氧-d-来苏-4-己酮糖还原酶)或其修饰的细胞产生。在一些实施例中，所述细胞在不存在岩藻糖的情况下培养。在一些实施例中，由缺少fut8或减少的fut8的表达的细胞产生。在一些实施例中，由在存在岩藻糖基化抑制剂2-氟岩藻糖(2ff)的情况下培养的细胞产生。

65、在一些实施例中，由过表达糖基转移酶(gntiii)的细胞产生。在一些实施例中，已基于其岩藻糖基化状态分离。在一些实施例中，包括fc区，所述fc区缺少fc部分的n-聚糖的核心岩藻糖基化。在一些实施例中，所述abp是去岩藻糖基化的单克隆抗体。

66、在一些实施例中，所述abp选自抗ctla-4抗体或其抗原结合片段、抗pd-l1抗体或其抗原结合片段、抗pd1抗体或其抗原结合片段、tigit抗体或其抗原结合片段、lag-3抗体或其抗原结合片段、cd47抗体或其抗原结合片段、braf抗体或其抗原结合片段、mek抗体或其抗原结合片段以及pi3k抗体或其抗原结合片段。

67、在一些实施例中，所述abp包括：(a)由seq id no:12078组成的cdr1-l、由seq idno:12079组成的cdr2-l、由seq id no:12080组成的cdr3-l、由seq id no:12075组成的cdr1-h、由seq id no:12076组成的cdr2-h以及由seq id no:12077组成的cdr3-h；(b)由seq id no:1014组成的cdr1-l、由seq id no:2014组成的cdr2-l、由seq id no:3014组成的cdr3-l、由seq id no:4014组成的cdr1-h、由seq id no:5014组成的cdr2-h以及由seqid no:6014组成的cdr3-h；(c)由seq id no:12004组成的cdr1-l、由seq id no:12014组成的cdr2-l、由seq id no:12024组成的cdr3-l、由seq id no:12039组成的cdr1-h、由seq idno:12049组成的cdr2-h以及由seq id no:12059组成的cdr3-h；(d)由seq id no:12005组成的cdr1-l、由seq id no:12015组成的cdr2-l、由seq id no:12025组成的cdr3-l、由seqid no:12040组成的cdr1-h、由seq id no:12050组成的cdr2-h以及由seq id no:12060组成的cdr3-h；(e)由seq id no:12006组成的cdr1-l、由seq id no:12016组成的cdr2-l、由seq id no:12026组成的cdr3-l、由seq id no:12041组成的cdr1-h、由seq id no:12051组成的cdr2-h以及由seq id no:12061组成的cdr3-h；(f)由seq id no:12007组成的cdr1-l、由seq id no:12017组成的cdr2-l、由seq id no:12027组成的cdr3-l、由seq id no:12042组成的cdr1-h、由seq id no:12052组成的cdr2-h以及由seq id no:12062组成的cdr3-h；或(g)由seq id no:12008组成的cdr1-l、由seq id no:12018组成的cdr2-l、由seq id no:12028组成的cdr3-l、由seq id no:12043组成的cdr1-h、由seq id no:12053组成的cdr2-h以及由seq id no:12063组成的cdr3-h。

68、在一些实施例中，所述abp包括可变轻链(vl)和可变重链(vh)，所述vl包括与seqid no:14至少97％相同的序列，所述vh包括与seq id no:114至少97％相同的序列。

69、在一些实施例中，所述abp包括：(a)由seq id no:12081中任何一个组成的cdr1-l、由seq id no:12082组成的cdr2-l、由seq id no:12083组成的cdr3-l、由seq id no:12084组成的cdr1-h、由seq id no:12085组成组成的cdr2-h以及由seq id no:12086组成的cdr3-h。

70、在一些实施例中，所述abp包括可变轻链(vl)和可变重链(vh)，所述vl包括与seqid no:12088至少97％相同的序列，所述vh包括与seq id no:12087至少97％相同的序列。

71、在一些实施例中，所述药物组合物的ph为5.0至6.5。在一些实施例中，所述药物组合物包括20mm的组氨酸或柠檬酸盐缓冲液。在一些实施例中，所述药物组合物包括50mm的nacl。在一些实施例中，所述药物组合物包括浓度为170mm至270mm的蔗糖。在一些实施例中，所述药物组合物包括170mm或270mm的蔗糖。在一些实施例中，所述药物组合物包括5mg/ml至20mg/ml的所述abp。在一些实施例中，所述药物组合物包括20mg/ml的所述abp。在一些实施例中，所述药物组合物包括5mg/ml的所述abp。

72、本公开的各方面包含一种治疗疾病的方法，所述方法包括以下步骤：向有需要的受试者施用有效量的所述abp或所述药物组合物。

73、在一些实施例中，所述疾病选自由以下组成的组：癌症、aids、阿尔茨海默氏病和病毒或细菌感染。在一些实施例中，进一步包括向所述受试者施用一种或多种另外的治疗剂的步骤。

74、在一些实施例中，所述另外的治疗剂选自化疗剂、免疫刺激剂、放射、细胞因子、编码细胞因子的多核苷酸、编码细胞因子的溶瘤病毒及其组合。

75、本公开的各方面包含一种分离的多核苷酸，其编码所述abp。本公开的各方面包含一种载体，其包括所述分离的多核苷酸。本公开的各方面提供了一种宿主细胞，其包括本公开的所述分离的多核苷酸或所述载体。在一些实施例中，所述宿主细胞进一步包括细菌蛋白rmd(gdp-6-脱氧-d-来苏-4-己酮糖还原酶)。在一些实施例中，所述宿主细胞在不存在岩藻糖的情况下培养。在一些实施例中，所述宿主细胞缺少fut8或具有减少的fut8的表达。在一些实施例中，所述宿主细胞在存在岩藻糖基化抑制剂2-氟岩藻糖(2ff)的情况下培养。在一些实施例中，所述宿主细胞过表达糖基转移酶(gntiii)。

76、本公开的各方面提供了一种产生与人ctla-4特异性结合的分离的抗原结合蛋白(abp)的方法，所述方法包括：诱导所述abp在所述宿主细胞中的表达；以及分离所述abp。

77、在一些实施例中，进一步包括基于所述abp的岩藻糖基化状态分离所述abp的步骤。在一些实施例中，所述宿主细胞在包括岩藻糖基化抑制剂的培养基中培养。在一些实施例中，所述岩藻糖基化抑制剂是2-氟岩藻糖(2ff)。

78、本公开的各方面提供了一种减少受试者的ctla-4hi treg的方法，所述受试者具有有限的剩余treg的增殖，所述方法包括施用有效剂量的所述abp或所述药物组合物。

79、在一些实施例中，所述受试者是人类受试者，任选地是患有黑色素瘤、rcc(肾细胞癌)、nsclc(非小细胞肺癌)、默克尔细胞癌、cscc、间皮瘤、msi结直肠癌、卵巢癌或宫颈癌的人类受试者。

80、在一些实施例中，进一步包括向所述受试者施用一种或多种另外的治疗剂的步骤。在一些实施例中，所述受试者患有具有高水平的treg、高水平的ctla-4、高水平的nk细胞或高水平的激活fcr的肿瘤。

81、本公开的各方面提供了一种减少受试者的ctla-4hi treg的方法，所述受试者具有有限的剩余treg的增殖，所述方法包括向所述受试者施用有效剂量的抗原结合蛋白(abp)，所述abp与人细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla-4)特异性结合。

82、在一些实施例中，所述受试者是人类受试者，任选地是患有黑色素瘤、rcc(肾细胞癌)、nsclc(非小细胞肺癌)、默克尔细胞癌、cscc、间皮瘤、msi结直肠癌、卵巢癌或宫颈癌的人类受试者。

83、在一些实施例中，进一步包括向所述受试者施用一种或多种另外的治疗剂的步骤。

84、在一些实施例中，所述abp包括可变轻链(vl)和可变重链(vh)，所述vl包括与seqid no:14至少97％相同的序列，所述vh包括与seq id no:114至少97％相同的序列。

85、在一些实施例中，所述abp包括：(a)由seq id no:中任何一个组成的cdr1-l、由seq id no:1001-1028中任何一个组成的cdr2-l、由seq id no:3001-3028中任何一个组成的cdr3-l、由seq id no:中任何一个组成的cdr1-h、由seq id no:3001-3028中任何一个组成组成的cdr2-h。

86、在一些实施例中，所述abp包括：可变轻链(vl)和可变重链(vh)，所述vl包括与seqid no:1-28中任何一个至少97％相同的序列，所述vh包括与seq id no:101-128至少97％相同的序列。