一种Jurkat效应细胞及其构建方法和用途与流程

本发明涉及一种效应细胞及其构建方法和用途，具体涉及一种jurkat效应细胞及其构建方法和用途。

背景技术：

1、肿瘤免疫治疗是通过调动机体的免疫系统，增强肿瘤微环境抗肿瘤免疫力，从而控制和杀伤肿瘤细胞。近几年，随着car-t和tcr-t技术的发展，使得肿瘤免疫治疗焕发新春，并进入大爆发阶段。其中，car-t已经在血液肿瘤上显示出治愈肿瘤的潜力。嵌合抗原受体(car)和t细胞受体(tcr)修饰的t细胞是当前过继性细胞治疗技术中最新和最富有成效的技术，实现了从基础免疫学机制研究到临床肿瘤免疫治疗应用的转变。因其能够表达人工合成受体并能特异性识别靶细胞，car-t和tcr-t正成为振奋人心的肿瘤治疗方法。

2、car和tcr特异性分子序列设计和筛选，以及结构优化和评价是目前各大公司和学术结构在开发car-t和tcr-t产品中所面临的最关键问题。比如，目前传统筛选方法以高亲和力为指标选择car分子，无法区分肿瘤细胞和正常细胞。在临床中，肿瘤特异性不高的car-t细胞在杀伤癌细胞的同时会攻击正常细胞，从而对患者正常生理功能产生副作用。此外，car除了特异性识别肿瘤靶抗原以激活t细胞发挥杀伤功能，其本身car分子在t细胞表面的表达密度，折叠构象，以及共刺激因子等结构特性都可能会激活t细胞的非抗原依赖的信号，被称为tonic信号。当这种tonic信号过强时，在没有靶抗原刺激下，该信号便可过度激活t细胞，诱导t细胞分化，加速t细胞耗竭，从而减少car-t在体内的存续性，进而影响其抗肿瘤功能。因此，开发同时能够评价car以及tcr分子亲和性、特异性和tonic信号的高效甚至高通量的评估体系，是推动car-t和tcr-t疗法进一步拓展的关键步骤。

3、jurkat细胞是人白血病t淋巴细胞，具有原代t淋巴细胞的相应特点与功能，表面表达cd3等抗原，通过基因工程改造可成为用于cd3双抗以及car或tcr分子特异性评估的效应细胞。目前常用的如jurkat-nfat-luc细胞，该效应细胞构建的原理是基于tcr/cd3复合物或car分子被靶向刺激后导致细胞内plc-γ的磷酸化和活化，进而激活nfat通路的转录，从而使nfat-re介导的荧光产生，最终利用荧光信号的强弱来反应抗体或car分子的特异性。与nfat相类似的还有如基于41-bb或cd69信号通路构建的jurkat效应细胞，但是这些基因的表达调控不仅通过直接的抗原刺激而被激活，而且还被其他炎症介质(例如i型干扰素和白介素)间接激活。因此，并不是很合适用于tonic信号的评估。nur77(nr4a1)作为核受体家族转录因子，它的表达可作为淋巴细胞抗原特异性激活的分子标志物，已经在人胸腺组织和基因报告小鼠中得到证实，同时在小鼠模型中也证明它对i型干扰素或细胞因子刺激没有反应。

4、因此，本发明提供了一种基于nur77信号通路的基因工程改造的jurkat效应细胞的构建方法以及该效应细胞的具体用途，对car或者tcr分子的功能评估具有重大意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于解决传统的jurkat效应细胞面临的无法同时高效精准的检测car以及tcr分子亲和性、抗原依赖的特异性信号以及非抗原依赖的tonic信号等问题。通过基因编辑的策略，构建一种基于nur77信号通路的jurkat效应细胞，可同时高效精准并且快捷方便的评估car或tcr分子的抗原依赖的特异性信号以及非抗原依赖的tonic信号。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种构建jurkat效应细胞的方法，包括以下具体步骤：

3、通过在jurkat细胞中对nur77基因终止密码子区域进行基因编辑的同时，将报告基因定点并同框敲入nur77基因的编码框，以保证报告基因的表达调控同内源性nur77基因的表达一致。

4、较佳的，将基因编辑物质递送至jurkat细胞所使用的基因编辑方法可以是zfn、talen或/和crispr-cas9等；优选crispr-cas9，cas9可以为spcas9、sacas9、spcas9-hf、espcas9、xcas9、cpf1或其它不同菌属的cas9；更优选spcas9。

5、较佳的，基因编辑物质可以是质粒、病毒、dna、mrna或/和rna蛋白复合体；优选rna蛋白复合体或/和同源修复的模板dsdna。

6、较佳的，基因编辑物质的递送可以使用脂质体、磷酸钙、deae-葡聚糖、电穿孔、显微注射或基因枪的转染方法；优选电穿孔转染。

7、在一些实施方案中，crispr-cas9基因编辑物质包括cas9 mrna、cas9蛋白或/和sgrna。优选使用cas9蛋白和sgrna形成的rnp复合体进行电转。rnp复合体可以通过直接混合温育cas9蛋白和sgrna获得，或者通过将二者混合于特定缓冲液(诸如电转缓冲液)中获得。

8、在一些实施方案中，sgrna的设计是首先明确敲入的基因组位点，利用该位点周围的dna序列设计的。设计的原则是pam区序列为ngg，其中n为a、t、c和g中的任一碱基。sgrna包括靶向的crrna序列和tracrrna序列，其中crrna可以是17、18、19、20、21或22个碱基，优选20个碱基。

9、在一些实施方案中，sgrna是未经修饰的或化学修饰的。化学修饰包括2-o-甲基化、3-硫代、2-o-甲基化结合3-硫代等。

10、在一些实施方案中，5’和3’端3个碱基同时进行2-o-甲基化和3-硫代修饰。化学修饰可以发生在sgrna的5’和3’端的1至10个碱基。设计好的sgrna可以通过t7体外转录获得，也可以直接体外合成。

11、在一些实施方案中，基因编辑物质还包括用于编辑位点处同源修复的模板dsdna。同源修复模板dsdna包括左同源臂dna、敲入的外源报告基因、右同源臂dna。模版dna的左同源臂与dna切口5’端序列同源，右同源臂与dna切口3’端序列同源。

12、在一些实施方案中，左右同源臂片段长度可选50至1000个碱基，优选150个碱基。敲入的报告基因需要与内源性nur77基因同框表达，以通过报告基因的表达来反映内源性基因的表达水平。报告基因可以是荧光蛋白基因、荧光素酶基因、氯霉素乙酰基转移酶基因、二氢叶酸还原酶基因、β-半乳糖苷酶基因和β葡萄糖醛酸酶基因中的至少一种；优选绿色荧光蛋白基因和荧光素酶基因组合的双重报告基因。

13、在一些实施方案中，内源nur77基因和报告基因以剪切肽隔开，剪切肽可选自t2a、p2a、e2a和f2a中的至少一种；优选p2a和t2a的组合。

14、在一些实施方案中，同源修复模板dsdna合成完成后可克隆连接至质粒载体中，质粒载体可以是任意的一种，例如puc57、pcdna3.1、pcmv等，连接的位置也可以是灵活的。也可以不连接至质粒载体，直接进入后续步骤。

15、在一些实施方案中，同源修复dsdna的获得可以利用未修饰或修饰的引物进行pcr扩增，修饰引物采用5’-硫代磷酸结合5’-biotin-teg或5’-锁核酸进行修饰。模版dsdna在经过pcr扩增后，可分别或联合采用以下几种方法进行纯化浓缩：各试剂公司的dna纯化试剂盒纯化、各种dna结合磁珠纯化、凝胶层析、离子层析、亲和层析、超滤管超滤、透析膜透析等。

16、在一个实施方案中，本发明还公开了一种在nur77编码框后定点敲入绿色荧光蛋白基因和荧光素酶基因双重报告基因的jurkat效应细胞的建立方法，将合成的grna同修复模板dsdna电转染jurkat细胞，经筛选得到所述jurkat效应细胞。

17、较佳地，其包括以下步骤：

18、步骤1、nur77 grna序列的设计和评估；

19、步骤2、同源修复模板dsdna的分子设计和制备；

20、步骤3、用电转的方法将cas9-sgrna rnp复合物以及模板dsdna转染进jurkat细胞；

21、步骤4、采用荧光素酶活性测定的方法，筛选和验证报告基因敲入的细胞池；

22、步骤5、从报告基因敲入的细胞池中筛选和验证正确敲入的单细胞克隆。

23、其中所述sgrna如seq id no:1～7中至少一项所示，优选为seq id no:1、seq idno:3或/和seq id no:6所示；其中所述修复模板dsdna如seq id no:8所示。

24、本发明还提供了一种jurkat效应细胞的应用，其一方面可用于car、tcr和bcr分子以及抗体特异性功能筛选和评价，尤其是对car分子抗原依赖信号和非抗原依赖的tonic信号的精准检测；其另一方面可用于高通量筛选抗体展示文库的car分子。

25、本发明的优点是：选择了在jurkat细胞中同时将两种报告基因(gfp和luciferase基因)定点敲入nur77基因的编码框，以构建一种基于nur77信号通路的jurkat效应细胞。该效应细胞可通过流式和荧光素酶实验来测定nur77信号强弱以评估car或tcr的特异性功能。

26、1、通过选择靶向nur77信号通路构建效应细胞，相比现有技术，可以更精准的测定car或tcr分子非抗原依赖的tonic信号，更利于快速筛选和评估出较优的car或tcr分子用于体内或临床验证，有利于加速car-t或tcr-t项目的研发进程。

27、2、通过选择双重报告基因，实验方法上选择将更加灵活和方便。由于多数car分子在抗原刺激下将诱发t细胞上car分子的内吞，不适合流式精准检测car阳性细胞群的抗原特异性信号，因此，可选择测定荧光素酶来代替流式检测gfp信号，更利于综合评估出最优的car或tcr分子。

28、3、目前car分子基本来源于已经经过亲和性和特异性验证的抗体序列的scfv或vhh，而大量的实验结果也表明优异的抗体分子并不一定适合在car-t上使用。因此，适合car-t的cars分子和结构的高通量筛选技术平台需要建立和完善。而本发明构建的jurkat效应细胞，将非常适合用于抗体展示文库起始的car分子高通量筛选，相比传统抗体文库的多轮淘选和验证，基于jurkat效应细胞的筛选流程将更方便、更快捷和更经济，筛选出的car分子和结构本身就是为car-t量身定制的。

29、4.本发明方法可以高效地建立nur77位点定点同框敲入luc和gfp双重报告基因的稳定细胞系。