基于二极管光调技术的可见光调控血管生成的方法及用途

1.本发明属于生物技术及光疗应用技术领域，涉及一种基于二极管(leds)光调技术的可见光调控血管的方法及用途，本方法可用于建立在合并毛细血管扩张的黄褐斑等色素增生性皮肤疾病的治疗平台。


背景技术：

2.临床实践显示了黄褐斑是一种常见的好发于中青年女性、深肤色人群的获得性色素增加性皮肤病，临床上常表现为面部对称的、不规则形的黄褐色色素沉着斑。目前黄褐斑的发病机制尚不明确，有研究发现血管改变及血液流变学异常等因素亦参与黄褐斑的发病。组织学研究表明，黄褐斑并不仅仅是一种局限于黑素细胞的疾病。与周围健康组织相比，黄褐斑的皮损处可以观察到日光性弹力胶原增殖、真皮肥大细胞增多、血管生成增加和基底膜的破坏。因此，目前本领域学者认为黄褐斑是一种光老化疾病。临床实践中，根据血管参与情况可将黄褐斑分为单纯色素型和色素合并血管型。由于其病因复杂、确切发病机制尚不明了，且目前的治疗效果尚不尽人意，因此亟需寻求一种温和有效、适用于黄褐斑长期维持控制的治疗方法。
3.临床实践中，光调作用(photobiomodulation)或低能量光疗(low-level laser therapy，lllt)，指的是利用光子通过非热损伤作用改变生物活性。而发光二极管(light emitting diodes,leds)，被称为第四代照明光源、绿色光源，具有节能、环保、寿命长、体积小等特点。多年来，leds光调作用已应用于对抗皮肤光老化、疱疹病毒感染、促进创面愈合、抗瘢痕形成、治疗银屑病及特应性皮炎等皮肤科领域。其中590nm的leds黄光具有操作简便、温和安全、可家用、不良反应少、费用较便宜的优势。weiss等应用590nm leds黄光为900多名患者进行光疗，研究发现单用leds光光疗的患者中，90％的受试者自觉皮肤质地的改善和皮肤纹理的减少，60％的患者出现面部纹理、红斑和色素沉着的整体改善，在黄褐斑的治疗领域有一定的前景。本研究课题组前期以20j/cm2医用585nm leds黄光疗仪对黄褐斑患者进行治疗，治疗结束后平均黄褐斑面积和严重指数评分下降，临床上还可观察到患者面部红斑明显缓解，且经visia图像分析后面部红色区域明显缩小。业内研究者关注，除了对黑素细胞的直接作用及通过角质形成细胞间接调控黑素合成，leds黄光对人血管内皮细胞的表型及功能是否有一定影响？
4.基于现有技术的基础与现状，本技术的发明人拟提供一种基于二极管(leds)光调技术的可见光调控血管的方法及用途，本方法可用于制备治疗在合并毛细血管扩张的黄褐斑等色素增生性皮肤疾病的制品中。
5.本发明将通过研究leds光调作用对人微血管内皮细胞的生物学特性的影响，探索一种调节人微血管内皮细胞血管生成的新方法，进一步尝试从血管的角度阐释590nm leds黄光干预影响黄褐斑的机制。本发明将为在合并毛细血管扩张的黄褐斑等色素增生性皮肤疾病的治疗与医疗美容方面提供重要帮助。
064nm调q nd∶yag激光，且其缓解红斑的效果更为明显，表明，leds590nm黄光可作为黄褐斑的一种温和有效的干预措施，尤其对于合并血管扩张的黄褐斑患者的干预更为有效。本发明的临床试用试验结果表明，leds光具备温和安全、价格低廉、技术难度较低、可以家用等优点。
17.本发明的基于二极管(leds)光调技术的可见光调控血管的方法可用于制备治疗在合并毛细血管扩张的黄褐斑等色素增生性皮肤疾病的制品，如，建立合并毛细血管扩张的黄褐斑等色素增生性皮肤疾病的治疗和长期维持的平台。
附图说明
18.图1：cck8法和annexin v-fitc/pi流式双染法检测leds光照后对细胞活性和凋亡的影响。
19.图2：划痕实验检测leds光照后的人微血管内皮细胞的迁移能力。
20.图3：成管实验检测leds光照后的人微血管内皮细胞的成管能力。
21.图4：rt-pcr和elisa实验检测leds光照后的人微血管内皮细胞合成和分泌vegfa和scf。
22.图5：western blot法检测leds光照后的人微血管内皮细胞内akt/pi3k/mtor通路磷酸化水平。
23.图6：leds 590nm黄光通过抑制akt/pi3k/mtor通路抑制人微血管内皮细胞的迁移能力和分泌vegfa。
24.图7：leds 590nm黄光能够有效缓解黄褐斑患者的面部红斑。
具体实施方式
25.本发明结合实施例和相应附图做进一步阐释说明，以下实施例仅用于说明目的，不用于限制本发明范围。
26.实施例1、leds光照对离体的人微血管内皮细胞活性和凋亡的影响试验
27.离体的人微血管内皮细胞细胞的培养：细胞株购买自上海冠导生物工程有限公司；将购入装有人微血管内皮细胞株的t25培养瓶表面消毒，静置于co2培养箱中培养2h；弃去原有培养基，加入5ml完全培养基(dmem+10％fbs+1％双抗)；待所述人微血管内皮细胞生长至70％-80％融合时，弃去原有培养基，用pbs洗涤3遍；加入1ml胰蛋白酶-edta(0.25％)消化细胞，约30s后细胞开始变圆漂浮，于显微镜下观察细胞形态；细胞开始变圆漂浮、脱离瓶底后，立即加入等量的完全培养基终止消化；轻拍瓶身，用巴氏吸管吸取细胞悬液，于低速离心机中1000r/min离心5min；弃去废液，加入适量完全培养基重悬细胞，以2
×
105/ml的密度接种于t25培养瓶中，37℃5％co2条件下培养，根据细胞生长状态2-3天传代一次。
28.细胞活性的检测：取第10代以内处于对数生长期的人微血管内皮细胞，以1
×
104/孔的密度接种于96孔板，37℃培养24h；采用不同剂量590nm leds照射细胞，每组剂量设三个复孔；照光结束后12h、24h及48h在每孔细胞中加入10ul cck-8液；将96孔板置于37℃培养箱中继续培养，在加入cck-8液后0-4h内每小时用酶标仪测定450nm处的吸光度值，计算细胞活力，三个复孔结果取平均值；选取不同代数的细胞进行三次重复实验。
29.细胞凋亡的检测：取第10代以内处于对数生长期的人微血管内皮细胞，以5
×
105/
孔的密度接种于6孔板，37℃培养24h；采用不同剂量590nm leds黄光照射细胞；24h后用不含edta的0.25％的胰酶消化每组细胞，转移至15ml离心管中于1000r/min离心5min；弃去上清，用4℃pbs重悬细胞，400g离心5min，洗涤细胞2次；使用双蒸水将10
×
binding buffer稀释至1
×
，每管加入300ul binding buffer重悬细胞并转移至流式上样管；每管加入5μlannexin v fitc与5μl pi，混匀后避光室温孵育15分钟；每管细胞补加200μl 1
×
binding buffer，30min内上机；选取不同代数的细胞进行三次重复实验，结果采用flowjo软件进行分析。
30.实施例2、划痕实验检测leds光照后的离体的人微血管内皮细胞的迁移能力
31.划痕实验：在直尺的辅助下用马克笔在6孔板板底画横线，每孔等间距通过3条横线；取第10代以内处于对数生长期的离体的人微血管内皮细胞，以5
×
105/孔的密度接种于6孔板，37℃5％co2条件下培养至细胞生长至100％融合；使用200ul枪头垂直于培养板板底，在每孔板底垂直于标记的横线划三条等距纵线,用pbs洗涤脱落细胞；使用不同剂量590nm leds黄光照射细胞；照射细胞后换用无血清培养基，将6孔板置于37℃培养箱中继续培养，在划线后0h、24h、48h使用倒置显微镜拍摄每条划痕相同位置的明场照片，采用image j软件计算划痕面积，计算划痕愈合率；选取不同代数的细胞进行三次重复实验。
32.实施例3、成管实验检测leds光照后的离体的人微血管内皮细胞的成管能力
33.成管实验：取第10代以内处于对数生长期的离体的人微血管内皮细胞，以5
×
105/孔的密度接种于6孔板，37℃培养24h；采用不同剂量590nm leds黄光照射细胞；matrigel基质胶4℃冰箱过夜融解，96孔板、200ul枪头4℃过夜预冷；96孔板置于冰上，每孔加入50ul matrigel基质胶，置于37℃培养箱1h后，置于4℃冰箱平衡10分钟；将照光后24h的人微血管内皮细胞以5
×
104/孔的密度接种于铺被有基质胶的96孔板；置于37℃培养箱中培养8h，使用倒置显微镜拍摄明场照片，采用image j软件计算成管数；选取不同代数的细胞进行三次重复实验。
34.实施例4、rt-pcr和elisa实验检测leds光照后的离体的人微血管内皮细胞合成和分泌vegfa和scf
35.rt-pcr实验：将待抽提的6孔板用pbs洗涤底部细胞一遍，每孔细胞中加入500ultrizol裂解液，反复吹打混匀，室温静置5min；抽提rna；根据primescripttm rt mastermix反转录试剂盒说明配置反转录体系：2μl 5x primescript rt master mix+500ng rna样本，加入depc水补充至10μl；将配置好的样本置于pcr仪，根据试剂盒说明设定反转录程序为：37℃，15min，85℃，5s；4℃，保持；对所获cdna样本进行稀释10倍；根据tb green premix ex taqtmⅱ试剂盒说明配置10ul反应体系；将配置好的样本置于quantstudio 6pcr仪系统进行rt-pcr扩增，根据试剂盒说明设定反应程序为：stage 1：循环数：1，95℃，30s；stage 2：循环数：40，95℃，5s，60℃，34s。
36.elisa实验：提取细胞上清液；将干预后的6孔板中的细胞上清液转移至标记好的1.5mlep管中，300g离心10min，-80℃贮存待用；制备标准曲线；将样本用双蒸水稀释浓缩洗液至1
×
,加入300μl洗液浸泡30s；96孔板每孔加入100ul标准品以及待测细胞上清液，每孔加入50μl 1:100稀释的检测抗体，用封板膜封板；室温孵育2h；弃掉96孔板中液体，每孔加入300μl洗液洗板，振荡30s后弃掉洗液，在吸水纸上拍干，洗涤6次；将辣根过氧化物酶标记链霉亲和素1:100稀释；每孔加入100μl稀释的辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，用新的封
板膜封板；300r/min振荡，室温孵育45min；清洗；每孔加入100μl显色底物tmb，避光室温孵育20min；每孔加入100μl终止液，轻叩板框以充分混匀；检测od值，并计算。
37.实施例5、western blot法检测leds光照后的离体的人微血管内皮细胞内akt/pi3k/mtor通路磷酸化水平
38.western blot法：使用不同剂量leds 590nm黄光光照离体的人微血管内皮细胞；照光后0.5h使用pbs洗涤细胞1次，将适量强效ripa裂解液与1％pmsf混合均匀，制备蛋白样品；将4％-12％bis-tris12孔预制胶装入固定架，放入电泳槽；在电泳槽中倒入电泳液，拔出梳子，补满电泳液，将制备的蛋白样品及预染蛋白marker按顺序进行上样，用废样补齐两侧空余加样孔；对应正负极盖上盖子，使用电泳仪以150v 60min进行蛋白电泳；再使用甲醇激活pvdf膜，之后置于pvdf膜平衡液中平衡1min；在转膜夹标记为正极的一侧平铺1张海绵垫，先将pvdf膜平铺于海绵垫，再将凝胶平铺于膜上，并用滚轮轻轻滚动去除气泡，最后在凝胶上平铺海绵垫，关闭转膜夹装入快速转膜仪；使用快速湿转仪进行转膜，参数设置为2
×
4.5min；封闭；孵育抗体；最后显影：用滤纸吸去多余液体，将pvdf膜平铺于10cm培养皿上，将显影液均匀滴在pvdf膜上直至完全浸没，避光孵育3min，置于化学发光图像分析系统中显影；采用image j软件分析条带灰度。
39.实施例6、leds 590nm黄光通过抑制akt/pi3k/mtor通路抑制离体的人微血管内皮细胞的迁移能力和分泌vegfa
40.igf-1预处理细胞：取生长情况良好的离体的人微血管内皮细胞，以5
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105/孔的密度接种于6孔板，置于37℃5％co2的细胞培养箱中培养24h；弃去原有培养基，在无酚红dmem培养基中加入50ng/ml igf-1，每孔加入1ml含有igf-1的培养基，置于培养箱中预处理2h；使用不同剂量590nm leds黄光照射细胞，进行后续实验。
41.后续划痕实验和elisa实验同前所述。
42.实施例7、leds 590nm黄光有效缓解黄褐斑患者的面部红斑的临床试用试验
43.纳入11名符合纳入标准，并签署书面知情同意书的黄褐斑患者，使用led光谱治疗仪(厂家：徐州市科诺医学仪器设备有限公司，型号：kn-7000c，输出波长：590
±
10nm，功率密度：10mw/cm2，有效辐照面积：26cm2±
10％，医疗器械注册证编号：苏械注准20162261288)进行居家光疗，波长590
±
10nm，连续模式，照射光强10mw/cm2，辐照距离：2cm
±
1cm，治疗照射时长5分钟，每天1次，连续16周，总照射剂量为21j/(cm2*周)，临床试用试验结果显示，试用的患者双侧面颊处黄褐斑好转，且红斑指数明显下降，表明本发明的方法有助于建立缓解合并毛细血管扩张的黄褐斑等色素增生性皮肤疾病的干预治疗和长期维持干预治疗的平台。