经修饰的DAAO酶及其应用的制作方法

本发明涉及酶工程领域。具体而言，本发明涉及经修饰的d-氨基酸氧化酶(daao)及其在生产草铵膦中的应用。

背景技术：

1、草铵膦(glufosinate，也称为4-[羟基(甲基)膦酰基]-d,l-高丙氨酸)是世界销量第二的转基因作物耐受的除草剂。草铵膦是一种广谱触杀型除草剂，通过抑制植物体内的l-谷氨酰胺合成酶的活性，导致植物体内氮代谢紊乱，最终杀死植物。与草甘膦相比，草铵膦具有显著优势，如应用范围广、见效快、持效期长、更低毒、安全等。因此，草铵膦的销量增长迅速，在未来一段时间内市场需求巨大，前景非常广阔。

2、但是，草铵膦的工艺路线复杂，导致产品生产技术难度高。高昂的价格阻碍其迅速取代草甘膦。目前市售的草铵膦是包含等量的两种光学异构体的外消旋混合物(d,l-草铵膦)，但其中只有l-构型具有生理活性。因此，通过d,l-草铵膦去消旋化制备手性纯的l-草铵膦具有重要现实意义，成为近年来合成l-草铵膦的热门方向。

3、近年来报道从d,l-草铵膦制备l-草铵膦的方法众多。传统的化学修饰拆分法因成本高且不能利用d-型草铵膦而不具备竞争性。目前报道了下列将d-草铵膦转化成为l-草铵膦的主要代表性技术路线：

4、1.将d,l-草铵膦转化成n-乙酰基草铵膦，再经羧肽酶催化，l型n-乙酰基草铵膦经选择性水解，获得l-草铵膦，而d型n-乙酰基草铵膦不水解，可经化学或酶法消旋化后再次循环进入水解步骤(参见例如中国专利申请cn108690854a)。该方法的缺点是需多步反应，还有需要将经水解获得的l-草铵膦与n-乙酰化的底物分离。

5、2.将d-草铵膦氧化成2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(简称ppo)，再对ppo进行还原或转氨生成l-草铵膦。在大部分文献中，使用d-氨基酸氧化酶(daao)催化将d-草铵膦氧化成ppo，其中通常还需要添加过氧化氢酶(cat)以移除生成的过氧化氢。ppo可以在钯碳催化下被甲酸还原生成d,l-草铵膦，利用daao的立体选择性，将d,l-草铵膦逐渐转化为l-草铵膦(参见，例如，cn105567780a)。这个方案的缺点是钯碳催化剂用量大，并且浪费反应原料(如氧气和甲酸铵)。

6、还可以采用l-氨基酸转氨酶(l-ta)催化的立体选择性转氨反应将ppo转化成l-草铵膦(参见，例如，us20180030487a1)。这个方案的缺点在于，转氨步骤是平衡反应，需要提供过量的氨基供体(氨基酸或有机胺)来实现高转化率(例如提供3倍当量的氨基供体，转化率90％)，而过量的氨基供体和对应的副产物将严重影响后续的分离纯化步骤。

7、此外，可以通过l-氨基酸脱氢酶(l-aadh)催化的立体选择性还原反应，将ppo转化为l-草铵膦(参见，例如，cn107502647a、cn109576236a和cn109609582a)。这种方案中，转化的底物浓度低或损失大。

8、比较上述方案，采用d-氨基酸氧化酶配合l-氨基酸脱氢酶的方案，具有潜在的成本优势。但目前报道过的方法中，可以转化的底物浓度普遍不高，或是损失过大，造成生产成本过高。实现高浓度的d,l-草铵膦去消旋化，成为目前的工艺瓶颈。

9、阻碍更高浓度的底物转化的主要因素可能是：重组的daao酶稳定性较差而在反应釜的条件下不稳定，反应过程中酶失活。

10、另一个限制性因素是酶对d-草铵膦的选择性催化活性。现有技术中对daao进行了一些修饰来赋予daao对d-草铵膦的活性：

11、·在us7,939,709中，使用来源于圆红冬孢酵母(rhodotorula toruloides，又名rhodotorula gracilis，参见https://www.atcc.org/products/all/10788.aspx)的daao的突变体实现了从d-草铵膦合成ppo的目的。该专利提及的圆红冬孢酵母daao突变体中包含f58k突变，在位置m213取代为h、s、t、c、q、g、n、和a的突变，以及在位置223和238的突变。tim hawks等在2011年发表的文章(d-glufosinate as a male sterility agent forhybrid seed production,plant biotechnology journal,(2011)9,pp.301-314)，报道了上述专利的类似内容，采用圆红冬孢酵母的daao，其包含58、213位的突变。

12、·在us9,834,802中，使用圆红冬孢酵母来源的daao的突变体配合转氨酶(ta)实现了从d,l-草铵膦合成l-草铵膦。还描述了该daao的位置54、56、58、213和238包含一个或多个突变，并例举了几种具体组合方式。

13、·在cn109576236a中，基于来自圆红冬孢酵母的daao，也构建了可以氧化d-草铵膦的突变体。所述突变体在氨基酸第52位、第54位、第58位、第213位和第335位进行单突变或多突变。

14、·在其他专利申请，如cn105567780a、cn109609582a中也涉及daao酶来氧化d-草铵膦，但未注明所用酶的序列。

15、但是，本领域仍需要提供具有更高的稳定性和/或对d-草铵膦具有更高活性的daao。

技术实现思路

1、在第一方面，本发明提供一种经修饰的d-氨基酸氧化酶(daao)，与其野生型daao相比，包含4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个位置的氨基酸取代，其中所述经修饰的daao具有催化d-草铵膦氧化为ppo的活性。

2、在一些实施方案中，所述经修饰的daao包含位置54、56、58和213的氨基酸取代，所述位置参照seq id no:2进行编号。优选地，位置54取代为i、v、t或l，更优选i或v。优选地，位置56取代为n。优选地，位置58取代为h或q，更优选h。优选地，位置213取代为s或t，更优选s。在一些实施方案中，所述经修饰的daao还包含位置210和/或221的氨基酸取代。优选地，位置210取代为a、g或p，更优选a。优选地，位置p221取代为r。

3、在一些实施方案中，所述经修饰的daao包含位置54、58、213和221的氨基酸取代，所述位置参照seq id no:2进行编号。优选地，位置54取代为v，位置58取代为q，位置213取代为s，位置221取代为r。在一些实施方案中，所述经修饰的daao还包含位置210和/或56的氨基酸取代。优选地，位置56取代为n，位置210取代为a。

4、在一些实施方案中，本发明的经修饰的daao还包含选自2、81、97、193、194、237、265、273、274、300、317、319、337和342的一或多个位置的取代。优选地，位置2取代为c或s，位置81取代为y，位置97取代为v，位置193取代为t，位置194取代为v或c，位置237取代为v，位置265取代为c，位置273取代为d，位置274取代为e，位置300取代为s或t，位置317取代为y或w，位置319取代为k，位置337取代为s，位置342取代为s或h。

5、或者，在一些实施方案中，本发明的经修饰的daao还包含选自194、237、265、273、274、300、317和319的一或多个位置的取代。优选地，位置194取代为v或c，位置237取代为v，位置265取代为c，位置273取代为d，位置274取代为e，位置300取代为s，位置317取代为y或w，位置319取代为k。

6、或者，在一些实施方案中，本发明的经修饰的daao还包含选自位置2、81、97、193、300、337和342的一或多个位置的取代，其中位置2取代为c或s，位置81取代为y，位置97取代为v，位置193取代为t，位置300取代为t，位置337取代为s，和位置342取代为s。

7、在一些实施方案中，所述经修饰的daao，其与seq id no:1相比，包含位置54、58、194和213的氨基酸取代，其中所述经修饰的daao具有催化d-草铵膦氧化为ppo的活性。优选地，位置54取代为i、v、t或l，位置58取代为h或q，位置194取代为v或c，位置213取代为s或t。在一些实施方案中，所述经修饰的daao还包含选自位置56、210、221、237、265、273、274、300、317和319的一或多个位置的氨基酸取代。优选地，位置56取代为n，位置210取代为a、g或p，位置p221取代为r，位置237取代为v，位置265取代为c，位置273取代为d，位置274取代为e，位置300取代为s，位置317取代为y或w，位置319取代为k。

8、在一些实施方案中，所述经修饰的daao，包含seq id no:5-86之一的氨基酸序列或由seq id no:5-86之一的氨基酸序列组成，或者所述经修饰的daao与seq id no:5-30和66-76之一相比，在除位置54、56、58、194、210、213、221、237、265、273、274、300、317和319之外的位置包含1-10个氨基酸取代，与seq id no:31-57和77-86之一相比，在除位置2、54、56、58、81、97、193、210、213、221、300、337和342之外的位置包含1-10个氨基酸取代，或与seq id no:58-65之一相比，在除位置54、56、58、210、213和221之外的位置包含1-10个氨基酸取代，其中所述经修饰的daao具有催化d-草铵膦氧化为ppo的活性。

9、在第二方面，本发明提供编码本发明的经修饰的daao的多核苷酸，以及包含本发明的多核苷酸的载体。

10、在第三方面，本发明提供包含本发明的的经修饰的daao、其编码多核苷酸或包含所述多核苷酸的载体的宿主细胞。

11、在第四方面，本发明还提供一种生产l-草铵膦的方法，包括使本发明的经修饰的daao或本发明的宿主细胞与d-草铵膦接触。