喉癌类器官模型的体外制备与冻存复苏方法与流程

本发明涉及器官模型的体外构建，特别涉及一种喉癌类器官模型的体外制备与冻存复苏方法。

背景技术：

1、喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤，约占人类肿瘤的1％-5％。它是耳鼻咽喉科和头颈外科第三常见的恶性肿瘤。98％的喉癌病理类型为鳞状细胞癌，声门是最常见的部位。近年来，喉癌的发病率呈上升趋势。因此，喉癌严重影响了世界人口的健康。呼吸困难、声音嘶哑、痰中有血和颈部淋巴结肿大都是这种疾病的常见症状，可对患者的生活产生严重影响。治疗喉癌的技术已逐步改进。在大多数情况下，手术是为了控制疾病进展和改善预后。小肿瘤可以通过手术或放疗进行治疗，而中等肿瘤可以通过部分喉切除术进行治疗，较大肿瘤可以通过全喉切除术进行治疗。目前，晚期喉癌患者的主要治疗方法是手术，其次是放疗和化疗。然而，目前尚不清楚这种方法是否有效。因此，揭开喉癌发生的分子机制及采用有效治疗战略非常重要。目前来说，喉癌的研究模型主要是喉癌细胞系和裸鼠移植瘤模型。虽然在喉癌发生发展的机制和治疗药物筛选上具有一定的参考意义，但是细胞系这种单细胞组分模型往往忽略了多细胞间或细胞与胞外基质间的相互作用；裸鼠移植瘤模型时间成本和经济成本较高。因此，一种包含多种喉癌相关细胞并能模拟喉癌微环境的体外模型亟待开发。

2、类器官是一种利用细胞干性构建的、具有多种特异细胞类型的体外研究模型，其可以来源于胚胎细胞、成人干细胞、多能干细胞和诱导多能干细胞等。到目前为止，多种人类上皮组织，包括结肠、胰腺、前列腺和乳腺等，均被报道可以形成体外类器官，而关于利用喉癌组织制备喉癌类器官的方法确鲜有报道。

3、近些年的研究表明，类器官不但能够很好地保留来源组织的表型和遗传特性，而且还具有复杂的内部结构，在功能及构造上趋近于相应体内结构。因此，基于多细胞组分的喉癌类器官体外肿瘤模型，可以很好地重现喉癌组织中肿瘤细胞与其他肿瘤相关细胞的互相作用，为深入研究喉癌发生发展的机制、喉癌药物筛选，以及用于评价免疫细胞对喉癌杀伤的体外药效提供了新途径。

4、据发明人对多种肿瘤类器官相关专利的调研发现，目前制备肿瘤类器官的方法主要是采用酶解法。喉癌组织具有质地坚韧、表面光滑且不易操作的特性，导致其使用单纯的酶解法仍难以有效的解离为单细胞来完成后续类器官培养；从分离肿瘤浸润淋巴细胞的方法中获得的经验提示，适时引入机械研磨法，可以大大提高喉癌组织的解离效率。此外，不像常规细胞冻存过程中的单细胞直接冻存与复苏，由于肿瘤类器官是由多细胞组成的类组织团状结构，这种结构的存在加大了类器官的冻存复苏难度，导致使用常规的单细胞冻存液难以实现肿瘤类器官的冻存复苏。因此，如何高效解离喉癌组织制备喉癌类器官，以及实现喉癌类器官的成功冻存复苏方法显得迫在眉睫。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种喉癌类器官模型的体外制备与冻存复苏方法，其不仅可以在较短时间内得到模拟喉癌微环境的类器官模型，而且可以将制备的喉癌类器官成功冻存复苏，为进一步喉癌发生发展机制的研究、高通量喉癌药物筛选，以及评价免疫细胞对喉癌杀伤效果提供平台支持。

2、本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

3、一种喉癌类器官模型的体外制备与冻存复苏方法，包括以下步骤：

4、(1)将喉癌组织进行清理除杂，切割；

5、(2)联合酶解法与机械研磨法将组织解离为单细胞悬液；

6、(3)基质胶包被喉癌单细胞，并等待基质胶凝固；

7、(4)加入喉癌类器官培养基，静置培养；每隔2天使用喉癌类器官培养基半量换液，维持培养；

8、(5)第14天取喉癌类器官消化传代，消化后的细胞按步骤(3)-(5) 的培养方法继续培养；

9、(6)收集要冻存的喉癌类器官，消化解离，按步骤(3)-(5)，培养 4天后冻存。

10、(7)将冻存的类器官水浴复苏，按步骤(3)-(5)，维持培养。

11、优选地，步骤(1)具体为：收到的新鲜喉组织用无菌pbs反复冲洗，直至pbs浣洗液澄清，使用一次性手术刀切割洗净的喉癌组织，大小为1- 3mm3的小块。

12、优选地，步骤(2)具体为：使用酶消化1-3mm3的喉癌组织，放入37℃二氧化碳培养箱消化60min，后置于100μm细胞滤网上，用5ml注射器针芯研磨，促进其解离为单细胞悬液，离心去上清，使用1ml pbs重悬。

13、优选地，步骤(3)具体为：将解离的喉癌单细胞，使用计数仪计数，记录细胞密度，将解离的喉癌单细胞使用pbs调整细胞密度为10000个细胞/10ul后，按照基质胶：细胞悬液的体积比为4：1混合均匀制成混悬液，接种于24孔板，每孔接种混悬液的的体积为50μl，然后放入37℃二氧化碳培养箱，静置20min，待基质胶凝固后，加入喉癌类器官培养基1ml入每个单孔；

14、所述喉癌类器官培养基包括：1％青霉素/链霉素、10mmol/l 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)、1×l-谷氨酰胺(glutamax)、10μmol/l rock 抑制剂、0.5μg/ml卡泊芬净、1×b27细胞培养添加剂、1.25mmol/l n-乙酰半胱氨酸、10mmol/l烟酰胺、50ng/ml表皮生长因子(egf)、10 ng/ml成纤维细胞生长因子10(fgf-10)、5ng/ml成纤维细胞生长因子 2(fgf-2)、500nmol/l tgf-βi型受体抑制剂(a83-01),1μmol/l前列腺素 e2(pge2),0.3μmol/l糖原合酶激酶-3(gsk-3)抑制剂,1μmol/l腺苷酸环化酶激活剂(fsk),4％(vol/vol)rspo-1条件培养基and 4％(vol/vol) noggin-fc融合蛋白条件培养基和高级dmem/f12培养基。

15、优选地，步骤(4)具体为：接种后在喉癌类器官培养基中置于37℃， 5％co2培养箱中静置培养，可观察每个孔形成初始细胞团；第3天半量换液一次，使用移液枪紧贴培养基液面，吸弃孔中500μl培养基，并加入等量喉癌类器官培养基，每间隔2天，重复一次该操作。

16、优选地，步骤(5)具体为：培养至第14天，使用1ml移液枪，吸弃上清，沿着24孔板壁加入500μl/孔的类器官回收液，冰上孵育60-90min，视基质胶完全溶解即可；

17、基质胶完全溶解后，使用1000μl移液枪收集24孔板中所有类器官混合液置15ml离心管，用预冷的pbs定容到10ml；4℃下以200g离心5分钟后，弃去上清，沉淀即为喉癌类器官；

18、离心后，弃去上清，按照每8个孔的喉癌类器官加入1ml tryple的比例重悬类器官沉淀，放入37℃二氧化碳培养箱孵育5min消化。消化结束后，加入10ml pbs稀释tryple，4℃下以200g离心5分钟后，弃去上清，再重复一次10ml pbs洗涤；收集的类器官单细胞继续培养。

19、优选地，步骤(6)具体为：基质胶完全溶解后，使用1000μl移液枪收集24孔板中所有类器官混合液置15ml离心管，离心去上清后使用 tryple重悬，放入37℃二氧化碳培养箱孵育5min消化，消化结束离心去上清后，收集的类器官单细胞按步骤(3)-(6)的培养方法继续培养；

20、回收需要冻存的喉癌类器官；离心后，弃去上清，按照每8个孔的喉癌类器官加入1ml tryple的比例重悬类器官沉淀，放入37℃二氧化碳培养箱孵育5min消化；消化结束后，加入10ml pbs稀释tryple，4℃下以 200g离心5分钟后，弃去上清，再重复一次10ml pbs洗涤；

21、收集的类器官单细胞培养4天后，再次回收类器官；按每4个孔的喉癌类器官加入1ml冻存液a的比例重悬类器官沉淀，使用细胞冻存盒冻存类器官；

22、将冻存喉癌类器官在37℃水浴锅中快速解冻，后加入5ml pbs稀释解冻的类器官-冻存液混合物，离心弃上清，按步骤(3)-(5)的培养方法继续培养。

23、一种根据上述的喉癌类器官模型的体外制备与冻存复苏方法制备得到的喉癌类器官模型。

24、一种根据上述方法制备的喉癌类器官模型在制备用于治疗喉癌药物中的应用。

25、一种根据上述的方法制备的喉癌类器官模型在高通量喉癌药物筛选以及评价免疫细胞对喉癌杀伤效果中的应用。

26、本发明上述技术方案，具有如下有益效果：

27、本技术根据喉癌组织具有质地坚韧、表面光滑且不易操作的特性，选用酶解法和机械研磨法联合的方式，有效解离喉癌组织，成功分离喉癌单细胞。

28、考虑到喉癌细胞培养生长的特点，选用多种细胞因子成份按照一定的比例进行调和，并使用3d培养的方式，使喉癌细胞能够有效的形成喉癌类器官，且培养形成的原代喉癌类器官可以实现传代培养。

29、本发明的体外制备、冻存和复苏方法，这些方法操作简易，构建迅速，且可操作性强，适用于研究喉癌发生发展机制、喉癌药物高通量筛选以及用于评价免疫细胞对喉癌杀伤的体外模型等，具有产业化意义。