鸡传染性支气管炎KC疫苗毒株及其制备方法、疫苗与流程

本发明涉及生物工程，尤其涉及一种鸡传染性支气管炎kc疫苗毒株及其制备方法、疫苗。

背景技术：

1、鸡传染性支气管炎(infectious bronchitis，ib)是由鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis，ibv)感染引起的一种严重危害家禽养殖业的高传染性疾病。ibv属于γ-冠状病毒，ibv和其他冠状病毒一样，具有高突变性和重组能力，导致抗原置换和漂移，继而产生变种。迄今为止，ibv已有30多种血清型，但不同血清型之间交叉保护性差，使该病近年来的流行呈上升趋势。传统单价疫苗h120、h52、w93和二联苗la sota/hb1+h120，lasota/b1+h52的使用虽然能有效抑制同源毒株但不能对异源毒株产生有效的交叉抑制。疫苗免疫的压力促进了主流毒株的突变，进而导致新毒株的崛起，旧的免疫方式失效。因而研发快速应对新的突变株的新型疫苗迫在眉睫。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于，提供一种鸡传染性支气管炎标记疫苗毒株，其可有效区分受检动物所携带的病毒是来自于疫苗接种还是自然感染，为ibv标记疫苗提供标记位点参考。

2、本发明还要解决的技术问题在于，提供一种鸡传染性支气管炎标记疫苗毒株的制备方法。

3、本发明还要解决的技术问题在于，提供一种鸡传染性支气管炎标记疫苗。

4、为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于扩增鸡传染性病毒kc流行毒株中s1序列的引物对，包括第一引物和第二引物，其核苷酸序列分别如seq id no.1和seq idno.2所示

5、作为上述技术方案的改进，还包括第三引物、第四引物、第五引物、第六引物、第七引物、第八引物、第九引物和第十引物；

6、其中，第三引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，第四引物的核苷酸序列如seqid no.4所示，第五引物的核苷酸序列如seq id no.5所示，第六引物的核苷酸序列如seqid no.6所示，第七引物的核苷酸序列如seq id no.7所示，第八引物的核苷酸序列如seqid no.8所示，第九引物的核苷酸序列如seq id no.9所示，第十引物的核苷酸序列如seqid no.10所示。

7、相应的，本发明还公开了重组质粒，其特征在于，其由如上述的引物对扩增而得。

8、相应的，本发明还公开了重组质粒的制备方法，其包括：

9、(1)提取鸡传染性病毒kc流行毒株总rna，反转录为kc-s1 cdna；

10、(2)以所述kc-s1 cdna为模板，采用第一引物和第二引物扩增，得到第一扩增产物；

11、(3)以质粒载体、kc-s1 cdna、pibvcdna-5e质粒为模板，采用第三引物、第四引物、第五引物、第六引物、第七引物、第八引物、第九引物和第十引物扩增，得到第二扩增产物；

12、(4)将第一扩增产物和第二扩增产物同源重组、转化，得到pbr-322-r5e-kc质粒。

13、作为上述技术方案的改进，所述质粒载体为pbr322 vector(delet tcr+)。

14、相应的，本发明还公开了一种鸡传染性支气管炎kc疫苗毒株的构建方法，其包括：

15、(1)制备上述的重组质粒，并基于该质粒构建ribv-beaudette-kc病毒全长cdna重组质粒；

16、(2)采用ribv-beaudette-kc病毒全长cdna重组质粒转染细胞，拯救后即得。

17、作为上述技术方案的改进，步骤(1)中，将pibvcdna-1a质粒、pibvcdna-2b质粒、pibvcdna-3c质粒、pibvcdna-4d质粒和pbr-322-r5e-kc质粒连接，得到ribv-beaudette-kc病毒全长cdna重组质粒。

18、作为上述技术方案的改进，步骤(1)中，将pibvcdna-1a质粒、pibvcdna-2b质粒、pibvcdna-3c质粒、pibvcdna-4d质粒和pbr-322-r5e-kc质粒分别用bamb i、bsa i、bsa i、bsa i和bsa i酶切回收，所得片段进行t4连接，得到ribv-beaudette-kc病毒全长cdna重组质粒。

19、相应的，本发明公开了一种鸡传染性支气管炎kc疫苗毒株，其由上述的构建方法构建所得。

20、相应的，本发明公开了一种鸡传染性支气管炎kc毒株标记疫苗，其包括如上述的鸡传染性支气管炎kc疫苗毒株。

21、实施本发明，具有如下有益效果：

22、本发明基于特定的引物，以beaudette-p65为骨架，将beaudette(s1)编码区的第297-532位氨基酸替换成qx型流行毒kc毒株的s1，其他序列保持不变。成功拯救出重组病毒ribv-beau-kc(s1)。通过连续在spf鸡胚和vero细胞上传代，获得1株具有vero细胞适应性的重组毒株ribv-beau-kc(s1)-p10v9，eid50和tcid50分别为106.78/ml和105.23/ml，与母本毒相似增殖能力。

技术特征：

1.一种用于扩增鸡传染性病毒kc流行毒株中s1序列的引物对，其特征在于，包括第一引物和第二引物，其核苷酸序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示

2.如权利要求1所述的引物对，其特征在于，还包括第三引物、第四引物、第五引物、第六引物、第七引物、第八引物、第九引物和第十引物；

3.重组质粒，其特征在于，其由如权利要求1或2所述的引物对扩增而得。

4.重组质粒的制备方法，其特征在于，包括：

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述质粒载体为pbr322vector(delettcr+)。

6.一种鸡传染性支气管炎kc疫苗毒株的构建方法，其特征在于，包括：

7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，将pibvcdna-1a质粒、pibvcdna-2b质粒、pibvcdna-3c质粒、pibvcdna-4d质粒和pbr-322-r5e-kc质粒连接，得到ribv-beaudette-kc病毒全长cdna重组质粒。

8.如权利要求7所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，将pibvcdna-1a质粒、pibvcdna-2b质粒、pibvcdna-3c质粒、pibvcdna-4d质粒和pbr-322-r5e-kc质粒分别用bambi、bsa i、bsa i、bsa i和bsa i酶切回收，所得片段进行t4连接，得到ribv-beaudette-kc病毒全长cdna重组质粒。

9.一种鸡传染性支气管炎kc疫苗毒株，其特征在于，其由权利要求6～8任一项所述的构建方法构建所得。

10.一种鸡传染性支气管炎kc毒株标记疫苗，其特征在于，其包括如权利要求9所述的鸡传染性支气管炎kc疫苗毒株。

技术总结
本发明公开了一种鸡传染性支气管炎KC疫苗毒株及其制备方法、疫苗，涉及生物工程技术领域。具体的，本发明基于特定的引物，以Beaudette‑p65为骨架，将Beaudette(S1)编码区的第297‑532位氨基酸替换成QX型流行毒KC毒株的S1，其他序列保持不变。成功拯救出重组病毒rIBV‑Beau‑KC(S1)。通过连续在SPF鸡胚和Vero细胞上传代，获得1株具有Vero细胞适应性的重组毒株rIBV‑Beau‑KC(S1)‑p10V9，EID<subgt;50</subgt;和TCID<subgt;50</subgt;分别为10<supgt;6.78</supgt;/mL和10<supgt;5.23</supgt;/mL，与母本毒相似增殖能力。

技术研发人员：陈瑞爱,熊挺,刘定祥
受保护的技术使用者：岭南现代农业科学与技术广东省实验室肇庆分中心
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13