一种核酸快速提取方法及组合物与流程

本发明涉及生物，具体涉及一种磁珠法病毒核酸快速提取的方法及组合物。

背景技术：

1、基于dna和rna分析的基因组学研究是现代分子生物学的一项热点。在临床医学诊断中，随着病毒核酸高通量提取需求日益增长，当前市面也应运产生多种病毒核酸提取试剂盒，其中以磁珠法核酸提取试剂盒应用最为广泛。磁珠法核酸提取主要采用超顺磁性硅基磁珠在高盐溶液中通过氢键和静电吸附核酸，而不吸附蛋白和其他杂质，吸附了核酸的磁珠经洗涤去除剩余的蛋白和盐离子，当使用低盐缓冲液时，磁珠释放核酸，从而达到快速分离纯化核酸的目的，该方法操作简便，不需要离心，适合高通量多样本自动化进行核酸的提取，获得的核酸可直接用于逆转录、pcr、荧光定量pcr、rt-pcr、rt-qpcr、二代测序、生物芯片分析等。磁珠法核酸提取试剂盒对病毒核酸的提取分为裂解、洗涤、漂洗和洗脱几个过程。

2、目前市面上的磁珠法的核酸提取试剂盒通常利用胍盐进行样本的裂解，胍盐促使细胞破裂、蛋白变性，同时胍盐在核酸和磁珠之间起到盐桥连接的作用从而增强磁珠对核酸的吸附。目前市面上的多类磁珠法核酸提取试剂盒通常需要搭配消解酶达到对样本充分裂解并释放核酸。如cn112458081a公布了磁珠法病毒核酸提取试剂盒的组分及使用过程，该病毒核酸的提取试剂由蛋白酶k溶液、裂解液、磁珠液、洗涤液ⅰ、洗涤液ⅱ、洗涤液ⅲ及洗脱液组成，但在实际的使用过程中，消解酶通常成本较高，需要低温运输，增加了提取试剂的原料成本和运输的困难，同时消解酶需要单独进行添加，增加了核酸提取的复杂度。

3、虽然市面上的核酸提取试剂盒能满足对病毒核酸的提取需求，但提取试剂盒普遍提取时间长，提取时间大概在10-30min之间，如cn113926432a公布的试剂盒需要30min完成核酸提取，cn114438076a公布的试剂盒需要20min完成核酸提取，cn112458081a公布的试剂盒最快9min完成病毒核酸的提取。在病毒核酸提取上如果提取时间长，一方面容易造成病毒核酸的降解，会影响下游的准确度；另一方面在病毒核酸的提取过程中，如果提取流程耗时长，会增加操作人员的病毒感染风险，除了在操作便捷方面，还有一些核酸提取试剂盒中含有毒性较强的试剂，不利于使用者的身心健康。

4、基于目前市面上磁珠法核酸提取试剂盒存在的一些弊端，开发一款成本低、提取时间快、无毒的病毒核酸提取试剂盒能方便使用者的操作与体验。

技术实现思路

1、本发明提供一种核酸提取组合物，该组合物可实现对核酸样本的高效裂解，同时能促进核酸与磁珠进行一步的结合，实现核酸高效提取回收；本发明还提供一种核酸提取方法，通过裂解、漂洗、洗脱三步简化了传统病毒核酸提取多步的流程，实现病毒dna/rna共提取，且可将整个提取时间控制在6min之内，提高核酸提取效率。

2、本发明的第一方面提供一种组合物，所述组合物包括聚丙烯酰胺、硫酸铝、甜菜碱、tris、edta钠盐或其水合物、peg8000、异硫氰酸胍、月桂醇聚氧乙烯醚、异丙醇、吐温。

3、在一些实施方案中，所述组合物中硫酸铝质量体积分数为0.1％-10％，例如0.1％、0.3％、0.5％、0.7％、0.9％、1％、2％、3％、5％、7％、10％；优选地，所述组合物中硫酸铝质量体积分数为1％。

4、在一些实施方案中，所述组合物中的聚丙烯酰胺质量体积分数为0.001％-0.1％，例如0.001％、0.01％、0.015％、0.02％、0.025％、0.03％、0.035％、0.04％、0.045％、0.05％、0.07％、0.1％；优选地，所述组合物中的聚丙烯酰胺质量体积分数为0.025％。

5、在一些实施方案中，所述组合物中的甜菜碱浓度为0.05mm-5mm，例如0.05mm、0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、3mm、5mm；优选地，所述组合物中的甜菜碱浓度为0.5mm。

6、在一些实施方案中，所述组合物中的tris浓度为10mm-1m，例如10mm、30mm、50mm、70mm、90mm、100mm、120mm、150mm、200mm、500mm、700mm、1m；优选地，所述组合物中的tris浓度为100mm。

7、在一些实施方案中，所述组合物中的edta钠盐或其水合物为edta·2na·2h2o，其浓度为1mm-100mm，例如1mm、5mm、10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm、50mm、70mm、100mm；优选地，所述组合物中的edta·2na·2h2o浓度为25mm。

8、在一些实施方案中，所述组合物中的peg8000质量体积分数为0.01％-1％，例如0.01％、0.05％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.4％、0.6％、0.8％、1％；优选地，所述组合物中的peg8000质量体积分数为0.1％。

9、在一些实施方案中，所述组合物中的异硫氰酸胍浓度为0.5m-10m，例如0.5m、1m、2m、3m、4m、5m、6m、7m、8m、9m、10m；优选地，所述组合物中的异硫氰酸胍浓度为5m。

10、在一些实施方案中，所述组合物中的月桂醇聚氧乙烯醚质量体积分数为0.01％-1％，例如0.01％、0.05％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.4％、0.6％、0.8％、1％；优选地，所述组合物中的月桂醇聚氧乙烯醚质量体积分数为0.1％。

11、在一些实施方案中，所述组合物中的异丙醇体积分数为10％-80％，例如10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％；优选地，所述组合物中的异丙醇体积分数为35％。

12、在一些实施方案中，所述组合物中的吐温20体积比为0.001％-0.1％，例如0.001％、0.005％、0.007％、0.008％、0.009％、0.01％、0.015％、0.02％、0.025％、0.03％、0.04％、0.06％、0.08％、0.1％；优选地，所述组合物中的吐温20体积分数为0.01％。

13、在一些实施方案中，所述组合物中硫酸铝质量体积分数为1％、聚丙烯酰胺质量体积分数为0.025％、甜菜碱浓度为0.5mm、tris浓度为100mm、edta·2na·2h2o浓度为25mm、peg8000质量体积分数为0.1％、异硫氰酸胍浓度为5m、月桂醇聚氧乙烯醚质量体积分数为0.1％、异丙醇体积分数为35％、吐温20体积分数为0.01％。

14、在一些实施方案中，所述组合物的ph范围为7-9，例如ph为7、7.5、8、8.5、9；优选地，所述组合物的ph为8。

15、在一些实施方案中，所述组合物作为核酸提取试剂用于核酸提取的用途。

16、在一些实施方案中，所述组合物作为核酸提取试剂用于磁珠法核酸提取的用途。

17、在一些实施方案中，所述组合物作为核酸提取试剂用于病毒核酸提取的用途。

18、在一些实施方案中，所述组合物作为核酸提取试剂用于磁珠法病毒核酸提取的用途。

19、本发明的第二方面提供一种核酸提取方法，所述方法包括使用本发明的第一方面所述组合物裂解核酸样本的步骤。

20、在一些实施方案中，所述核酸样本包括且不限于血液样本、组织样本、口腔样本、粪便样本。

21、在一些实施方案中，所述核酸提取方法中使用磁珠提取样本裂解后的核酸；优选地，提取样本裂解后的病毒核酸。

22、在一些实施方案中，所述核酸提取方法还包括漂洗和洗脱步骤。

23、在一些实施方案中，所述漂洗步骤中使用的漂洗液包括tris-base、氯化钠、异丙醇和盐酸胍。

24、在一些实施方案中，所述漂洗液中的tris浓度为5mm-500mm，例如5mm、10mm、20mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、100mm、300mm、500mm；优选地，所述漂洗液中的tris浓度为50mm。

25、在一些实施方案中，所述漂洗液中的氯化钠浓度为10mm-1m，例如10mm、30mm、50mm、70mm、90mm、100mm、120mm、150mm、200mm、500mm、700mm、1m；优选地，所述漂洗液中的氯化钠浓度为100mm。

26、在一些实施方案中，所述漂洗液中的异丙醇体积分数为10％-80％，例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％；优选地，所述漂洗液中的异丙醇体积分数为60％。

27、在一些实施方案中，所述漂洗液中的盐酸胍浓度为100mm-10m，例如100mm、500mm、700mm、800mm、900mm、1m、2m、3m、5m、7m、10m；优选地，所述漂洗液中的盐酸胍浓度为1m。

28、在一些实施方案中，所述漂洗液中的tris浓度为50mm、氯化钠浓度为100mm、异丙醇体积分数为60％、盐酸胍浓度为1m。

29、在一些实施方案中，所述漂洗液的ph范围为7-9，例如7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、8、9；优选地，所述漂洗液的ph为7。

30、在一些实施方案中，所述洗脱步骤中使用的洗脱液包括tris-hcl、edta和无核酸酶的蒸馏水。

31、在一些实施方案中，所述洗脱液中的tris-hcl浓度为0.1mm-5mm，例如0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、3mm、5mm；优选地，所述洗脱液中的tris-hcl浓度为0.5mm。

32、在一些实施方案中，所述洗脱液中的edta浓度为0.1mm-5mm，例如0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、3mm、5mm；优选地，所述洗脱液中的edta浓度为0.5mm。

33、在一些实施方案中，所述洗脱液中的tris-hcl浓度为0.5mm，edta浓度为0.5mm。

34、在一些实施方案中，所述洗脱液的ph范围为7-9，例如7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、8、9；优选地，所述洗脱液的ph为7。

35、本发明的第三方面提供一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述组合物。

36、在一些实施方案中，所述试剂盒还包括磁珠；优选地，所述磁珠为超顺磁性氧化硅羟基纳米微球，直径为20-1000nm、浓度为10-100mg/ml。

37、在一些实施方案中，所述试剂盒还包括漂洗液和洗脱液。

38、在一些实施方案中，所述漂洗液包括tris、氯化钠、异丙醇和盐酸胍；优选地，所述漂洗液中的tris浓度为50mm，氯化钠浓度为100mm，异丙醇体积比为60％，盐酸胍浓度为1m，ph为7。

39、在一些实施方案中，所述洗脱液包括tris-hcl、edta和无核酸酶的蒸馏水；优选地，所述洗脱液中的tris-hcl浓度为0.5mm，edta浓度为0.5mm，ph为7。

40、在一些实施方案中，所述试剂盒还包括实施本发明所述方法需要的其他试剂。