一种检测黄牛POLB基因缺失标记的方法

一种检测黄牛polb基因缺失标记的方法
技术领域
1.本发明属于家畜分子遗传学育种技术领域，具体涉及一种检测黄牛polb基因缺失标记的方法。


背景技术：

2.随着我国国民生活水平的提高，人们对牛肉的消费量也逐年提高。但是我国牛肉总体供给量小于消费量，一部分牛肉还需要依赖进口来填补空缺。为了进一步提高我国肉牛的生长性能，提升育种效率，将分子育种与常规育种技术相结合成为一种重要手段。而分子标记辅助选择(molecular mark-assist selection，mas)是分子育种中的一项关键技术，可以利用与生长性状相关的分子标记，从分子水平对优势等位基因快速、准确地选择。
3.polb是1971年weisssbach等首次从牛胸腺中分离出的一种dna聚合酶。该基因属于dna聚合酶x家族中的一员。dna聚合酶的家族成员在dna复制、dna损伤修复、细胞周期调控中起重要作用。zmudzka等在1986年先后从鼠和人中克隆出polb基因的dna序列。polb蛋白是真核细胞中最小的dna多聚酶，总共编码335个氨基酸，其蛋白分子质量仅为39ku。
4.polb主要功能是通过参与碱基切除修复(base excision repair,ber)系统对dna损伤进行修复。dna损伤在细胞中如不能得到有效修复，将易导致细胞的衰老、凋亡和癌变。研究发现，阻断蛋白激酶a(protein kinase a，pka)和p38分裂原活化蛋白激酶(p38mapk)信号途径，降低人食管癌细胞中polb基因的表达量，能够导致该细胞生物学特性发生改变，抑制细胞增殖、促进细胞凋亡。另外，在小鼠食管癌细胞和人口腔鳞状细胞癌细胞中，沉默或降低polb基因的表达可以调节细胞周期，导致有丝分裂异常，促进细胞增殖。采用rna干扰技术抑制乳癌细胞(mcf-7)中polb基因的表达，结果发现，细胞的增殖也受到显著抑制。沈亮研究发现，polb基因可能通过pi3k/akt信号通路对mcf-7的增殖和迁移进行调控。朱艳艳利用甲基苄基亚硝胺(nnitrosomethylbenzylamine,nmba)分别诱导polb基因敲除的小鼠食管上皮组织，经mrna转录组芯片及差异表达基因go功能富集分析发现，有33个差异表达的基因与细胞增殖调控相关，有27个差异表达的基因与细胞周期调控相关，其中涉及到pi3k/akt、mapk-erk等信号通路。以上报道表明，polb基因表达量的变化与细胞的增殖、凋亡、周期调控等活动关系密切。
5.然而，polb基因在牛生长性状方面的研究还较少，尚未见到基因多态性相关报道。


技术实现要素：

6.针对现有技术存在的缺陷和问题，本发明提供一种检测黄牛polb基因缺失标记的方法。
7.本发明解决其技术问题所采用的方案是：一种检测黄牛polb基因缺失标记的方法，以黄牛基因组dna为模板，以特异性引物对为引物，通过pcr扩增黄牛个体cds区上游基因部分片段，通过电泳检测pcr扩增产物；然后使用限制性内切酶maei对pcr产物直接进行酶切，对酶切后的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳检测结果判定黄牛个体的基因
型；所述引物对为：
8.f：5
’‑
actccaggttccttttactggc-3’；
9.r：5
’‑
gtcggtgatgcccccgt-3’。
10.上述的检测黄牛polb基因缺失标记的方法，pcr扩增的反应体系为：2
×
taq pcrmaster mix 5.00μl，ddh2o 3.00μl，p-f 0.5μl，p-r 0.5μl，dna模板1.0μl.
11.上述的检测黄牛polb基因缺失标记的方法，pcr扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸15s，38个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
12.上述的检测黄牛polb基因缺失标记的方法，酶切反应体系为：bfal 0.4μl，buffer 2μl，pcr产物2μl，ddh2o 15.6μl，反应温度37℃，反应时间8h。
13.上述的检测黄牛polb基因缺失标记的方法，所述琼脂糖凝胶电泳采用质量浓度为3％的琼脂糖凝胶。
14.上述的检测黄牛polb基因缺失标记的方法，野生基因型表现为93bp和267bp两个条带；缺失基因型表现为360bp条带；杂合基因型表现为93bp、267bp和360bp三个条带。
15.一种黄牛polb基因缺失多态性的检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括用于pcr扩增牛polb基因nc_037354.1cds区上游c.-221_-210del位12bp缺失突变位点的引物对，所述引物对为：
16.f：5
’‑
actccaggttccttttactggc-3’17.r：5
’‑
gtcggtgatgcccccgt-3’。
18.本发明的检测黄牛polb基因缺失标记的方法在黄牛分子标记辅助选择育种方面的应用。
19.上述的应用中，在由所述引物对扩增的缺失标记位点，个体对应的生长优势基因型为野生型。
20.本发明的有益效果：本发明以牛全基因组dna为模板，通过pcr扩增牛polb基因部分片段，应用琼脂糖凝胶电泳鉴定个体polb基因cds区上游12bp缺失突变位点的基因型。根据性状关联分析，polb基因12bp缺失突变位点的野生基因型与黄牛体斜长显著相关，可用于黄牛育种标记辅助选择，加强对野生型个体的选育以提高黄牛的生长性能。
附图说明
21.图1为本发明酶切电泳图谱。
22.图2为野生型测序图谱。
23.图3为缺失型测序图谱。
24.图4为杂合型测序图谱。
具体实施方式
25.下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明.
26.实施例1：本实施例提供一种检测黄牛polb基因缺失突变标记的方法，该方法主要包括以下内容。
27.1、引物设计
28.本发明根据genbank公布的牛polb基因(ncbi genbank登录号nc_037354.1)利用
oligo7和ncbi对polb基因cds上游c.-221_-210del缺失位点进行引物设计，引物序列为：
29.f(上游引物)5
′
－actccaggttccttttactggc－3
′
；
30.r(下游引物)5
′
―gtcggtgatgcccccgt―3
′
。
31.2、提取黄牛全基因组dna
32.本实施例按照基因组dna提取试剂盒提取郏县红牛血样的全基因组dna，具体步骤为：
33.(1)取200μl郏县红牛血样添加至1.5ml离心管；
34.(2)加入20μl proteinase k混匀；
35.(3)加入200μl gb缓冲液混匀，70℃静置10min；
36.(4)加入200μl无水乙醇，振荡器上振荡15s混匀；
37.(5)将上步骤中的混合液加入吸附柱cb3中，12 000rpm离心30s；
38.(6)弃液，向吸附柱cb3中加入500μl gd缓冲液，12 000rpm离心30s；
39.(7)弃液，向吸附柱cb3中加入600μl pw漂洗液，12 000rpm离心30s；
40.(8)重复(7)步骤；
41.(9)弃液，12 000rpm离心30s；
42.(10)弃液，并晾干；
43.(11)将吸附柱cb3转移至灭菌后的新的1.5ml离心管中，加入30μl无菌水，室温静置5min，12 000rpm离心2min；
44.(12)重复(11)步骤，然后，收集溶液-20℃保存。
45.3、dna纯度和浓度检测
46.(1)打开分光光度计，调选为检测dna，然后吸取1μl无菌水润洗仪器的点样部位，并用滤纸擦干；
47.(2)吸取1μl无菌水点样作为空白对照，再取1μl样品进行点样，并记录每个样本的浓度和纯度的读数；
48.(3)所测样品纯度要保证od
260
/od
280
值在1.8-2.0之间。
49.4、pcr反应
50.对提取郏县红牛的dna利用设计的引物序列：
51.f(上游引物)5
′
－actccaggttccttttactggc－3
′
；
52.r(下游引物)5
′
―gtcggtgatgcccccgt―3
′
，(引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)，进行pcr扩增，pcr反应体系见下表1；pcr扩增程序见下表2。
53.表1 pcr反应体系
[0054][0055]
表2 pcr扩增程序
[0056][0057][0058]
pcr扩增后，通过琼脂糖凝胶电泳检测所述pcr扩增的产物的条带大小，以判断是否扩增正确，pcr产物应为360bp。
[0059]
5、酶切及电泳
[0060]
利用snapgene viewer软件分析c.-221_-210del缺失位点，发现该位点上存在bfal(或名mael)(c/tag)酶切位点，使用限制性内切酶maei对pcr产物直接进行酶切，酶切体系见下表3。
[0061]
表3酶切体系
[0062][0063]
混匀，37℃，酶切8h。
[0064]
然后将酶切产物利用3％的琼脂糖凝胶电泳进行分型，具体步骤为：
[0065]
(1)利用电子天平称取琼脂糖0.75g,添加至250ml锥形瓶中；
[0066]
(2)用量筒量取25ml的1
×
tae溶液，添加至锥形瓶中并轻摇混匀后，放入微波炉中，调中火加热1.5min，直至琼脂糖完全溶解；
[0067]
(3)待溶液冷却至40℃左右，利用移液枪向其中加入2μl核酸染料，轻摇混匀后倒入插好梳子的制胶板中，待凝固大约30min后将梳子从胶中拔出，放至凝胶电泳仪内，添加1
×
tae溶液至液面没过胶体，并排出胶孔中的空气；
[0068]
(4)将15μl酶切产物点样至凝胶孔中，电压100v，电流100a电泳1h；
[0069]
(5)从电泳槽中将电泳后的凝胶取出，打开紫外凝胶成像系统，放入凝胶，关上门、打开紫外灯观察电泳条带，根据条带大小判定个体的基因型，酶切图谱见图1，不同基因型测序结果见图2-4。具体为：
[0070]
野生型：93bp 267bp
[0071]
缺失型：360bp
[0072]
杂合型：93bp 267bp 360bp。
[0073]
实施例2：本实施例提供一种检测黄牛polb基因缺失多态性的试剂盒，该试剂盒包括用于pcr扩增牛polb基因nc_037354.1cds区上游c.-221_-210del位12bp缺失突变位点的引物对，所述引物对为：
[0074]
f：5
’‑
actccaggttccttttactggc-3’；
[0075]
r：5
’‑
gtcggtgatgcccccgt-3’；
[0076]
还包括2
×
taq mastermix 5.00μl，ddh2o3.00μl，限制性内切酶maei及buffer2μl。
[0077]
实施例3：本实施例以71头郏县红牛血样作为实验材料，并进行dna提取，以郏县红牛dna为模板进行基因型鉴定。
[0078]
使用一般线性模型，将c.-221_-210del的多态性与郏县红牛体斜长性状进行关联分析，发现c.-221_-210del与郏县红牛体斜长显著相关。结果见表4。
[0079]
表4 c.-221_-210del多态性与郏县红牛体斜长性状关联分析结果
[0080][0081]
从表4可以看出，对于体斜长性状，野生型牛优于缺失型牛，野生型为优势基因型，应加强对野生型个体的选育以提高郏县红牛的生长性能。体斜长是反应牛生长性能的重要指标，与体重呈高度的遗传相关性。例如，海福特牛的育肥体长与胴体重遗传相关系数为0.86。在生产实践中可利用体斜长和胸围数据进行牛的体重估算。通过分子标记辅助选择对体斜长进行选育，对于提升牛只生长性能和产肉能力具有重要意义。