从中华雪胆中提取的具有抗乳腺炎活性的葫芦烷型四环三萜类化合物及其制备方法与应用

1.本发明涉及医药领域，特别是一种从中华雪胆中提取的具有抗乳腺炎活性的葫芦烷型四环三萜类化合物及其制备方法与应用。


背景技术：

2.中华雪胆为葫芦科雪胆属植物雪胆(hemsleya chinensis)的块茎，现收载于《贵州中药材民族药材质量标准》和《湖北中药材质量标准》。味苦，性寒，具有清热解毒、止痛止血、消肿利湿的功效，主治菌痢、肝炎、肠炎等症。中华雪胆广泛分布于我国西南部山区，如云南、四川、贵州等省，产量大且价钱低廉。长期以来，中华雪胆被作为西南地区的常用民间药物，用于牛羊等家畜乳腺炎疗效显著。现以中华雪胆等雪胆属植物提取物为原料开发上市的雪胆素片，已用于治疗菌痢、肠炎、支气管炎、急性扁桃体炎等，其主要活性成分为葫芦烷型四环三萜类成分雪胆素甲、雪胆素乙。但至今未见有从中华雪胆制备具有抗乳腺炎活性的化合物(hemchinin e)，也未有如何从中华雪胆中提取抗乳腺炎活性的葫芦烷型四环三萜类成分的公开报导。


技术实现要素：

3.针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种从中华雪胆中提取葫芦烷型四环三萜类化合物的制备方法及其应用，可有效解决从中华雪胆中提取葫芦烷型四环三萜类化合物，实现在制备治疗乳腺炎药物中的应用问题。
4.本发明解决的技术方案是，一种从中华雪胆中提取的葫芦烷型四环三萜类化合物hemchinin e，其分子式为c
30h44
o6，不饱和度均为9，结构式为：
[0005][0006]
其制备方法，包括以下步骤：
[0007]
(1)取干燥的中华雪胆块根30kg，每次加水150～300l，回流提取2～5次，每次提取2～4h，合并提取液，减压浓缩，得到相当于生药量1.0～3.0g/ml的样品溶液；
[0008]
(2)将步骤(1)的样品溶液上样于径高比1:4～1:12的d101大孔吸附树脂柱，依次用体积浓度30％、50％、70％的乙醇30～60l进行梯度洗脱，流速为2～6ml/min，收集70％乙醇部位洗脱液，减压浓缩，得到50℃相对密度1.2～1.4的浸膏fr.
70％etoac
；
[0009]
(3)浸膏fr.
70％etoac
经80～300目硅胶柱色谱，硅胶柱d＝6～12cm、h＝25～60cm，用体积比1:0、50:1、25:1、10:1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，每个比例洗脱3～10个柱体
积，收集25:1的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分fr.
70％etoac-3(15.9～23.7g)；
[0010]
(4)组分fr.
70％etoac-3经中压flashods柱色谱(220～330g)，用体积比45:55、60:40、70:30的甲醇-水进行梯度洗脱，流速20～25ml/min，每个比例洗脱3～10个柱体积，收集60:40的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分fr.
70％etoac-3-g(1.2～2.3g)；
[0011]
(5)组分fr.
70％etoac-3-g用甲醇溶解成50mg/ml的样品溶液，用c18柱在半制备hplc上进一步分离，洗脱溶剂为体积比35:65的乙腈-水，3ml/min，收集42.80min的色谱峰，减压回收溶剂，得到干燥粉末状的单体化合物(135.7～185.4mg)。
[0012]
本发明所述的从中华雪胆中提取葫芦烷型四环三萜类化合物在制备治疗乳腺炎药物中的应用。
[0013]
本发明经鉴定，是一个从中华雪胆提取的新的葫芦烷型四环三萜类化合物hemchinin e，其制备方法易操作，导向性强，产品纯度高，该化合物可有效用于制备治疗乳腺炎的药物，开拓了中华雪胆的药用价值和商业价值，经济和社会效益巨大。
附图说明
[0014]
图1为本发明hemchinin e的化学结构图。
[0015]
图2为本发明hemchinin e的关键1h-1
h cosy和hmbc相关图。
[0016]
图3为本发明hemchinin e的关键noesy相关图。
[0017]
图4为本发明hemchinin e的实验和计算ecd光谱图。
[0018]
图5为本发明的工艺流程图。
具体实施方式
[0019]
以下结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
[0020]
实施例1
[0021]
本发明在具体实施时，其制备方法如图5所示，包括以下步骤：
[0022]
(1)取干燥的中华雪胆块根30kg，每次加水250l，回流提取3次，每次提取3h，合并提取液，减压浓缩，得到相当于生药量1.5g/ml的样品溶液；
[0023]
(2)将步骤(1)的样品溶液上样于径高比1:8的d101大孔吸附树脂柱，依次用体积浓度30％、50％、70％的乙醇40l进行梯度洗脱，流速为4ml/min，收集70％乙醇部位洗脱液，减压浓缩，得到50℃相对密度1.3的浸膏fr.
70％etoac
；
[0024]
(3)浸膏fr.
70％etoac
经200目硅胶柱色谱，硅胶柱d＝8cm、h＝45cm，用体积比1:0、50:1、25:1、10:1、5:1、0:1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，每个比例洗脱8个柱体积，收集25:1的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分fr.
70％etoac-3(18.5g)；
[0025]
(4)组分fr.
70％etoac-3经中压flashods柱色谱(220g)，用体积比45:55、60:40、70:30的甲醇-水进行梯度洗脱，流速20ml/min，每个比例洗脱10个柱体积，收集60:40的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分fr.
70％etoac-3-g(1.7g)；
[0026]
(5)组分fr.
70％etoac-3-g用甲醇溶解成50mg/ml的样品溶液，经c18柱在半制备hplc上进一步分离，洗脱溶剂为体积比35:65的乙腈-水，3ml/min，收集42.80min的色谱峰，减压回收溶剂，得到干燥粉末状的单体化合物(152.3mg)。
[0027]
实施例2
[0028]
本发明在具体实施时，其制备方法如图5所示，包括以下步骤：
[0029]
(1)取干燥的中华雪胆块根30kg，每次加水150l，回流提取5次，每次提取2h，合并提取液，减压浓缩，得到相当于生药量3.0g/ml的样品溶液；
[0030]
(2)将步骤(1)的样品溶液上样于径高比1:12的d101大孔吸附树脂柱，依次用体积浓度30％、50％、70％的乙醇60l进行梯度洗脱，流速为6ml/min，收集70％乙醇部位洗脱液，减压浓缩，得到50℃相对密度1.2的浸膏fr.
70％etoac
；
[0031]
(3)浸膏fr.
70％etoac
经80目硅胶柱色谱，硅胶柱d＝10cm、h＝50cm，用体积比1:0、50:1、25:1、10:1、5:1、0:1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，每个比例洗脱10个柱体积，收集25:1的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分fr.
70％etoac-3(23.7g)；
[0032]
(4)组分fr.
70％etoac-3经中压flashods柱色谱(330g)，用体积比45:55、60:40、70:30的甲醇-水进行梯度洗脱，流速25ml/min，每个比例洗脱5个柱体积，收集60:40的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分fr.
70％etoac-3-g(2.3g)；
[0033]
(5)组分fr.
70％etoac-3-g用甲醇溶解成50mg/ml的样品溶液，经c18柱在半制备hplc上进一步分离，洗脱溶剂为体积比35:65的乙腈-水，3ml/min，收集42.80min的色谱峰，减压回收溶剂，得到干燥粉末状的单体化合物(185.4mg)。
[0034]
实施例3
[0035]
本发明在具体实施时，其制备方法如图5所示，包括以下步骤：
[0036]
(1)取干燥的中华雪胆块根30kg，每次加水300l，回流提取2次，每次提取4h，合并提取液，减压浓缩，得到相当于生药量1.0g/ml的样品溶液；
[0037]
(2)将步骤(1)的样品溶液上样于径高比1:4的d101大孔吸附树脂柱，依次用体积浓度30％、50％、70％的乙醇30l进行梯度洗脱，流速为2ml/min，收集70％乙醇部位洗脱液，减压浓缩，得到50℃相对密度1.4的浸膏fr.
70％etoac
；
[0038]
(3)浸膏fr.
70％etoac
经300目硅胶柱色谱，硅胶柱d＝6cm、h＝25cm，用体积比1:0、50:1、25:1、10:1、5:1、0:1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，每个比例洗脱3个柱体积，收集25:1的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分fr.
70％etoac-3(15.9g)；
[0039]
(4)组分fr.
70％etoac-3经中压flashods柱色谱(220g)，用体积比45:55、60:40、70:30的甲醇-水进行梯度洗脱，流速20ml/min，每个比例洗脱6个柱体积，收集60:40的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分fr.
70％etoac-3-g(1.2g)；
[0040]
(5)组分fr.
70％etoac-3-g用甲醇溶解成50mg/ml的样品溶液，经c18柱在半制备hplc上进一步分离，洗脱溶剂为体积比35:65的乙腈-水，3ml/min，收集42.80min的色谱峰，减压回收溶剂，得到干燥粉末状的单体化合物(135.7mg)。
[0041]
实施例4
[0042]
本发明在具体实施时，其制备方法如图5所示，包括以下步骤：
[0043]
(1)取干燥的中华雪胆块根30kg，每次加水200l，回流提取4次，每次提取2h，合并提取液，减压浓缩，得到相当于生药量2.0g/ml的样品溶液；
[0044]
(2)将步骤(1)的样品溶液上样于径高比1:6的d101大孔吸附树脂柱，依次用体积浓度30％、50％、70％的乙醇50l进行梯度洗脱，流速为4ml/min，收集70％乙醇部位洗脱液，减压浓缩，得到50℃相对密度1.2的浸膏fr.
70％etoac
；
[0045]
(3)浸膏fr.
70％etoac
经200目硅胶柱色谱，硅胶柱d＝12cm、h＝25cm，用体积比1:0、
50:1、25:1、10:1、5:1、0:1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，每个比例洗脱6个柱体积，收集25:1的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分fr.
70％etoac-3(20.9g)；
[0046]
(4)组分fr.
70％etoac-3经中压flashods柱色谱(330g)，用体积比45:55、60:40、70:30的甲醇-水进行梯度洗脱，流速25ml/min，每个比例洗脱3个柱体积，收集60:40的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分fr.
70％etoac-3-g(2.0g)；
[0047]
(5)组分fr.
70％etoac-3-g用甲醇溶解成50mg/ml的样品溶液，经c18柱在半制备hplc上进一步分离，洗脱溶剂为体积比35:65的乙腈-水，3ml/min，收集42.80min的色谱峰，减压回收溶剂，得到干燥粉末状的单体化合物(168.6mg)。
[0048]
要指出的是，上述实施例仅是用于说明本发明的具体实施方式，以对该从中华雪胆中提取具有抗乳腺炎活性的葫芦烷型四环三萜类化合物及其提取方法进行的详细描述，是说明性的，而不是用于限定本发明的保护范围，凡是在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，均应属本发明的保护范围之内，并经试验得到了证明，相关试验资料如下：
[0049]
一、结构鉴定
[0050]
本发明所制备化合物经测定，鉴定为从中华雪胆中提取的新的葫芦烷型四环三萜类化合物hemchinin e，分子结构式见图1所示。
[0051]
hemchinin e：白色无定形粉末，易溶于甲醇等有机溶剂。旋光度(c 0.1,ch3oh)；紫外光谱显示在203nm处有最大吸收峰；红外光谱提示该化合物存在羟基(3469cm-1
)，羰基(1695cm-1
)；hr-esi-ms谱显示准分子离子峰m/z 501.32132[m+h]
+
(c
30h45
o6计算值为501.32107)，结合1h-nmr、
13
c-nmr谱确定分子式为c
30h44
o6，不饱和度为9。
[0052]
根据1d nmr和hsqc谱显示三个酮羰基δ
c 214.7(c-22),212.7(c-11)，209.9(c-2)；两组双键(其中有一组末端双键)δ
h 5.85(d,j＝6.2hz,h-6),4.68(s,h-26),4.65(s,h-26)；δ
c 144.9(c-25),138.8(c-5),120.2(c-6),109.9(c-26)；一个连氧季碳δ
c 79.2(c-20)；两个连氧次甲基δ
h 3.83(s,h-3),4.34(t,j＝8.0hz,h-16)；δ
c 79.5(c-3),69.1(c-16)；七个甲基δ
h 1.68(s,h-27),1.23(s,h-21),1.19(s,h-28),1.17(s,h-30),1.01(s,h-19),0.75(s,h-29),0.79(s,h-18)；δ
c 24.1(c-28),25.0(c-21),21.3(c-29),22.6(c-27),18.3(c-30),19.6(c-19),19.8(c-18)，详细信息见表1。以上数据含有5个不饱和度，提示该化合物为四环三萜类化合物。
[0053]
结合1h-1
h cosy谱显示有四个自旋耦合片段h-10/h
2-1、h-6/h
2-7/h-8、h
2-15/h-16/h-17和h
2-23/h
2-24。hmbc谱(见图2)显示h
3-18与c-12、c-13、c-14、c-17相关，h
3-19与c-8、c-9、c-10、c-11相关，h
3-21与c-17、c-20、c-22相关，h
3-28/29与c-3、c-4、c-5相关，h
3-27与c-24、c-25、c-26相关，推测该化合物可能为葫芦烷型四环三萜类化合物；烯氢质子h-6与c-4、c-5、c-7、c-8、c-10相关，末端双键氢质子h
2-26与c-24、c-25、c-27相关，表明存在两个双键δ
25,26
和δ
5,6
；h
2-1、h-3、h-10分别与c-2位酮羰基相关，h-8、h-10、h
3-19、h
2-12分别与c-11位酮羰基相关，h-17、h
3-21、h
2-23、h
2-24分别与c-22位酮羰基相关，表明3个酮羰基的取代位置分别在c-2、c-11、c-22位；两个连氧氢质子h-3与c-1、c-2、c-4、c-5、me-28、me-29相关，h-16与c-14、c-15、c-13、c-17、c-20相关，结合化合物分子式，表明c-3、c-16位分别有游离羟基取代。综合以上信息，确定了该化合物的平面结构。
[0054]
该化合物的相对构型是通过noesy分析确定的(见图3)。noesy谱显示h-3与h
3-28相关，h-10与h
3-29相关，提示h-3与h-10分别处于异侧，分别暂定为β、α构型。由h
3-10与h-30
相关，h-30与h-17相关，提示h-17和h-30均为α构型。由h-8与h
3-18、h
3-19相关，h
3-19与h-1β相关，h
3-18与h-16相关，提示h-8、h-16、me-18和me-19均为β构型。化合物的ecd光谱在201nm和300nm处显示正的cotton效应。通过比较计算和实测ecd光谱，计算曲线与实验曲线吻合良好，但有轻微的峰移(见图4)，确定该化合物的c-3,c-8,c-9,c-10,c-13,c-14,c-16,c-17的绝对构型分别为s,s,r,r,r,s,r,r,r。综上确定化合物为2β,3α,16α,20-tetrahydroxycucurbita-5,25-dien-2,11,22-trione,分子结构式为：
[0055][0056]
表1.hemchinin e的1h和
13
c-nmr数据(500 and 125mhz in meod,δin ppm,j in hz)
[0057][0058][0059]
二、体内活性实验
[0060]
以化合物hemchinin e为主成分制备了一种治疗乳腺炎的药物，进行了体内活性实验。
[0061]
试验方法：6～8周龄昆明小鼠，适应性喂养一周后以雌性：雄性比例为3：1合笼饲养，每天给予充足的饮食饮水，分娩后的母鼠用于构建金黄色葡萄球菌性乳腺炎动物模型。将30只分娩5～7d的母鼠随机分为5组：空白对照组、模型组、阳性对照组(抗生素组)、高剂量给药组(150mg/kg)、低剂量给药组(75mg/kg)。除空白对照组外，其余各组进行金黄色葡萄球菌性小鼠乳腺炎模型的构建。将分娩5～7d母鼠腹腔注射麻药舒泰0.05ml/只，麻醉后将小鼠四肢伸展仰卧保定，用70％乙醇擦拭小鼠的第3、4对乳腺周围，左手持灭菌的小镊子将乳头固定，右手持微量注射器，从小鼠第4对乳腺基部进针注射细菌悬液，其中金黄色葡萄球菌液浓度为2
×
108cfu/μl。模型组、阳性对照组和各给药组分别灌胃生理盐水、环丙沙星(130mg/kg)和高、低剂量(150、75mg/kg)制备的药物，每天2次，0.3ml/次，连续给药7d，空白对照组不做处理。在给药3，5，7d，观察各组小鼠的精神状态、饮食和饮水情况。给药7d结束后，禁食16h，将小鼠脱颈处死。取乳腺组织，以质量体积比为1:5加入灭菌生理盐水，研磨成匀浆，取0.8ml匀浆液涂布于高盐甘露醇培养基上，37℃培养24h后用平板计数法测定金黄色葡萄球菌数。
[0062]
制备的治疗乳腺炎药物高、低剂量组均有显著的抗乳腺炎作用。在给药过程中，空白对照组小鼠采食、饮水正常，精神良好；模型组小鼠精神萎靡不振，运动、采食和饮水减少，乳腺肿胀溃烂；各给药组和阳性对照组小鼠精神状态、饮水和采食逐渐恢复，乳腺肿胀程度较模型组变化较小，溃烂程度较轻。给药7d后，与空白对照组对比，模型组小鼠乳腺组织中金黄色葡萄球菌数量(4.87
±
0.04)lg cfu/g呈现出极显著升高；与模型组对比，阳性对照组、高、低剂量给药组小鼠的乳腺组织中金黄色葡萄球菌数量(3.77
±
0.05)、(3.55
±
0.03)、(4.02
±
0.06)lg cfu/g均呈现出显著下降趋势。由此可以看出，制备的治疗乳腺炎药物在150、75mg/kg剂量下均可以显著抑制金黄色葡萄球菌性所致小鼠乳腺炎，具有很好的治疗乳腺炎活性。
[0063]
本发明经鉴定，是一个从中华雪胆提取的新的葫芦烷型四环三萜类化合物hemchinin e，其制备方法易操作，导向性强，产品纯度高，本发明葫芦烷型四环三萜类化合物hemchinin e作为治疗乳腺炎的先导化合物，有效用于制备治疗乳腺炎的药物，具有巨大的开发前景，经济和社会效益巨大。