具有高亲和力结合肿瘤细胞PD-L1的细胞膜材料及其制备方法和应用

本发明属于生物，具体涉及一种具有高亲和力结合肿瘤细胞pd-l1的细胞膜材料及其制备方法和应用。

背景技术：

1、随着纳米技术的发展，纳米粒作为药物递送载体已经在癌症的诊断和治疗领域得到了广泛的研究。然而，大多数纳米粒作为外来物质会被机体内的免疫系统识别和清除，以及生物相容性差，限制了这些纳米材料的实用性。因此，迫切需要寻求一种安全、有效和制备便捷的纳米递送系统逃逸免疫系统清除，以及增强的肿瘤靶向性。

2、基于仿生技术的生物膜介导的纳米药物递送系统利用细胞膜作为载体，在不考虑内核纳米材料特性的情况下，利用细胞膜表面蛋白质和多糖的功能促进核内纳米粒在体内的长循环和靶向递送，有望实现纳米技术在肿瘤靶向治疗上的新突破。自此，细胞膜仿生修饰纳米粒广泛地被探索和研究，如何开发创新型的细胞膜材料是目前研究面临的瓶颈问题。

3、鉴于此，特提出本技术。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种具有高亲和力结合肿瘤细胞pd-l1的细胞膜材料及其制备方法和应用，以克服现有细胞膜材料的缺乏，为纳米药物的递送提供载体。

2、本发明的技术构思：

3、细胞膜仿生纳米粒为药物高效递送至肿瘤部位提供解决方案，但如何开发具有靶向结合肿瘤细胞的细胞膜材料是目前面临的瓶颈问题。通过基因工程手段表达能靶向结合肿瘤细胞的特异蛋白于细胞膜表面的方式，为获得具有靶向结合肿瘤细胞表面配体的细胞膜材料提供解决途径。

4、发明人为了开发一种对肿瘤细胞有特异性识别能力的细胞膜材料，采用通过基因工程手段表达能靶向结合肿瘤细胞表面配体的特异蛋白于细胞膜表面的技术构想。因此，如何选取有效的能靶向结合肿瘤细胞表面配体的特异蛋白非常关键。调研文献发现，多种肿瘤细胞对程序性死亡受体配体-1(pd-l1)具有高表达，如黑色素瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、三阴性乳腺癌、肾细胞癌等。pd-l1通过与激活的t细胞表面程序性死亡受体-1(pd-1)特异性结合，活化pd-1/pd-l1下游通路，传递负性调节信号，进而导致激活t细胞的凋亡和免疫活性丧失，引起免疫逃逸。因此，pd-1/pd-l1结合位点可作为靶向结合肿瘤细胞的靶点，也为肿瘤免疫治疗提供了分子靶标。pd-1是由268个氨基酸组成的ⅰ型跨膜蛋白，主要表达于成熟的cd4+t细胞、cd8+t细胞、单核细胞、巨噬细胞、b细胞、树突状细胞等造血细胞，以及一些非造血细胞，如内皮细胞、胰岛细胞、肥大细胞等的膜表面。但是，天然的pd-1与pd-l1的亲和力较弱，通过设计不同的pd-1突变体，获得比天然的pd-1/pd-l1亲和力提高近4万倍的高亲和力的pd-1突变体(m-pd-1)。

5、综上，通过基因工程手段表达高亲和力的pd-1于宿主细胞膜表面，可获得增强的主动靶向结合肿瘤细胞表面pd-l1配体的细胞膜材料。利用该细胞膜材料对纳米粒表面进行修饰，可实现高效递送药物至肿瘤部位；同时，通过竞争性结合肿瘤细胞表面的pd-l1配体从而阻断t细胞表面的pd-1受体与pd-l1配体结合，进而恢复t细胞的抗肿瘤活性。所以，这种细胞膜材料的构建为开发具有靶向结合肿瘤细胞的细胞膜材料提供创新方案。

6、本发明通过以下技术方案实现：

7、第一方面，本发明提供一种具有高亲和力结合肿瘤细胞pd-l1的细胞膜材料的制备方法，其包括：

8、对pd-1的全长碱基序列进行定点突变，得到突变体m-pd-1的碱基序列；

9、采用荧光标记蛋白的碱基序列连接所述突变体m-pd-1的碱基序列，得到融合碱基序列m-pd-1-f；

10、利用表达质粒构建含有所述融合碱基序列m-pd-1-f的重组质粒；

11、将所述重组质粒转染至宿主细胞，并进行抗性筛选，得到能够稳定将所述突变体m-pd-1表达于细胞膜表面的重组细胞；

12、将所述重组细胞扩大培养，收集细胞后，提取细胞膜。

13、进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述突变体m-pd-1中至少有10个氨基酸位置发生碱基突变；

14、优选地，所述突变体m-pd-1的碱基序列如seq id no.1所示。

15、进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述在构建所述融合碱基序列m-pd-1-f的过程中，所述荧光标记蛋白的碱基序列是通过linker连接到所述突变体m-pd-1的碱基序列上的；

16、优选地，所述linker的碱基序列如seq id no.2所示。

17、进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述所述荧光标记蛋白包括红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、橙色荧光蛋白和黄色荧光蛋白中的任一种。

18、优选地，所述荧光标记蛋白为红色荧光蛋白，所述融合碱基序列m-pd-1-f的碱基序列如seq id no.3所示。

19、进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述在构建所述重组质粒的过程中，所述表达质粒包括pcmv3、pcmv6、pcdna3.1和pgl4.50中的任一种；

20、优选地，将所述融合碱基序列m-pd-1-f连接到所述pcmv3上，连接位点为hind iii和xba i。

21、进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述在构建所述重组细胞的过程中，所述宿主细胞包括hek 293t、cho、ns0、bhk和per-c6细胞中的任一种；

22、优选地，采用潮霉素b对所述宿主细胞进行抗性筛选；

23、优选地，所述潮霉素b的浓度为380～420μg/ml。

24、第二方面，本发明提供一种根据上述制备方法制得的具有高亲和力结合肿瘤细胞pd-l1的细胞膜材料。

25、第三方面，本发明提供一种根据上述具有高亲和力结合肿瘤细胞pd-l1的细胞膜材料在制备靶向肿瘤药物或诊断试剂中的应用。

26、第四方面，本发明提供一种治疗或诊断肿瘤的靶向药物递送载体，其包括由权利要求7所述的细胞膜材料制备的纳米粒，所述肿瘤为表达有所述pd-l1的肿瘤。

27、第五方面，本发明提供一种靶向肿瘤药物，包括活性药物分子以及上述细胞膜材料，所述细胞膜材料包裹在所述活性药物分子外。

28、与现有技术相比，本发明至少具有如下技术效果：

29、本发明通过基因工程的手段将突变型的pd-1表达于宿主细胞膜表面，可获得对肿瘤细胞表面pd-l1配体有主动靶向结合能力的细胞膜材料。利用该细胞膜材料对抗肿瘤纳米药物进行表面修饰，可实现高效递送药物至肿瘤部位；同时，通过竞争性结合肿瘤细胞表面的pd-l1配体从而阻断t细胞表面的pd-1受体与pd-l1配体结合，进而恢复t细胞的抗肿瘤活性。因此，这种新型细胞膜材料的构建为开发具有靶向结合肿瘤细胞的细胞膜材料提供创新方案。

30、相比于天然的细胞膜材料，本发明提供的这种表面表达有高亲和力的pd-1突变体的细胞膜材料具有如下优势：

31、1)本发明通过基因工程技术改造细胞膜，获得表达pd-1突变体的细胞膜材料，比天然细胞膜的pd-1/pd-l1亲和力提高近4万倍，功能更为强大的细胞膜材料；

32、2)本发明后处理简单便捷，能得到高品质的产物，且此方法可以放大操作，实现工业化。