一种复合微生物菌肥及其制备方法和应用

1.本发明涉及微生物领域，特别是涉及一种复合微生物菌肥及其制备方法和应用。


背景技术：

2.化肥作为粮食增产的关键保障，对农业生产做出了巨大贡献。化学肥料的普遍使用虽然可以暂时满足植物生长过程中对于氮、磷、钾的需求，但长时间的使用也容易造成土壤环境的污染和资源的浪费，如引起土壤酸化、水体富营养化等一系列环境问题，已经阻碍了农业生产和农作物生产。如何协同粮食安全、资源高效和环境保护已成为农业可持续发展面临的重大挑战，也是未来农业科技革命的突破口和多学科交叉创新的科学前沿。
3.环境友好型农业生态系统，主要由植物、微生物和土壤间相互作用组成，极为复杂。“植物-根系-根际-根际微生物”根际生命共同体理论体系的构建，突破植物-微生物、微生物-微生物关键界面互作机制，阐明根际生命共同体结构、功能及其在养分活化、吸收与利用中的作用机制，建立共同体多界面互作增效的生物学调控新途径，开辟植物-土壤-微生物交叉创新领域，根际生命共同体理论创新有助于破解粮食安全、资源高效、环境保护多目标协同的难题，支撑农业绿色发展。
4.将含有特定功能的微生物活体的微生物菌剂应用于农业生产，通过其中所含微生物的生命活动，增加植物对于土壤中所含氮、磷、钾等养分的吸收或促进植物生长，可以提高产量，从而改善农业生态环境。因此，利用“植物-根系-根际-根际微生物”的互作增效机制促进植物生长，提高养分效率，从根本上改变高投入、高污染的农业生产方式，既是目前农业科技创新的交叉前沿，又是协同作物产量、资源效率和环境安全的需要，也是响应农业绿色转型、可持续发展难题的突破口。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种复合微生物菌肥及其制备方法和应用，利用复合微生物菌肥中所含微生物的生命活动，以增加植物对于土壤中所含氮、磷、钾等养分的吸收或促进植物生长，提高产量，从而改善农业生态环境。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
7.本发明提供一株莫拉维假单胞菌(pseudomonas moraviensis)nif1-2，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m20211055，保藏日期为2021年8月23日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
8.本发明提供一株利尼假单胞菌(pseudomonas lini)nif2-6，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 20211057，保藏日期为2021年8月23日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
9.本发明提供一株假单胞菌(pseudomonas sp.)sip23-3，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 20211153，保藏日期为2021年9月9日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
10.本发明提供一株不动杆菌(acinetobacter sp.)sip23-7，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 20211152，保藏日期为2021年9月9日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
11.本发明还提供一种复合微生物菌肥，其活性成分包含上述的4株菌株。
12.本发明还提供上述的复合微生物菌肥的制备方法，包括：分别挑取菌株nif1-2、nif2-6、sip23-3和sip23-7的单菌落接入培养基中，经过两次扩培后获得六株菌株的活化后菌液，再将所得活化后菌液分别稀释后混合，得到混合稀释菌液，即为所述复合微生物菌肥。
13.进一步地，所述复合微生物菌肥与复合肥联用。
14.植物根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，pgpr)的促生作用可以直接或间接地影响植物的生长，其中解磷菌(phosphorous solubilizing microorganisms，psm)是一个重要亚群，其分泌低分子量有机酸被认为是参与磷溶解的主要机制，能将以po43-形式存在的难溶性磷转化为以hpo42-和h2po4-形式存在的植物可吸收利用的可溶性磷，为植物提供更多可用的磷，进而提高了不溶磷的利用率和解磷效率，并促进植物生长，改善土壤环境，促进农业生产。
15.空气当中氮气含量占78.03％，含量很充足，但是空气中的氮不能直接被植物利用。固氮微生物可通过不依赖于植物而靠自我固氮。可以将把空气中的氮气转化为氮肥，对农作物的产量的提高具有重要意义。
16.磷元素是植物中含量第五高的元素，是植物生长发育第1或第2位最常见的限制性营养素。磷在细胞结构、能量和信息存储以及能量和信息传递中起作用。植物的生长和发育过程中必需的有效磷矿物质元素由土壤供应，其中磷元素含量的高低也直接地影响着这些植物的生长发育。然而土壤中所含磷量相对较少，且这些磷在土壤中主要以不流动、不可溶的复合物的形式存在，主要有无机磷和有机磷两种方式，其中无机磷占绝大多数，阳离子-高磷酸盐复合物在土壤中相对不溶和稳定；这些包括铝和铁的氧化物和氢氧化物，不能被植物充分吸收和利用，只有0.1％的有机磷是可利用的。植物根际解磷菌，可以通过分泌一些有机酸或酶类，将不溶性无机磷酸盐或将有机磷分解成可溶性磷酸盐。如丛枝菌根真菌arbuscular mycorrhizal fungi(amf)促进植物对磷的吸收。目前的研究表明，在作物上接种溶磷菌(psb)有可能在不显著降低作物产量的情况下，将磷肥的用量降低50％。
17.解钾菌可以通过分泌酸性物质，溶解硅铝酸盐类矿物质，释放钾素营养，增加有效钾含量，促进植物生长，同时抑制其他病原菌的生长。
18.铁(fe)是植物必需的矿质营养元素，在光合作用等诸多生理代谢过程中发挥着重要的作用，但是由于其在土壤中的生物有效性低下，导致植物缺fe现象比较普遍。植物根系质外体空间被认为是植物重要的fe贮存库，快速、有效地利用根系的质外体fe是植物耐受缺fe生境的重要机制。
19.含有1-氨基环丙烷-1-梭酸(acc)脱氨酶活性的pgpr是一类能够通过吸收、分解植物根系分泌出的acc，并利用其分解产物α-丁酮酸和氨分别作为c源和n源，促使根系不断的向外分泌acc，从而降低根系中acc和应激乙烯的水平，减轻逆境下乙烯对植物的伤害，促进植物生长发育，提高植物产量的有益微生物。并且，这些根际细菌往往能通过产生3-呵噪乙酸(iaa)和嗜铁素等促生因子，来直接或间接地促进药用植物生长发育、提高其抗逆能力。
20.本发明公开了以下技术效果：
21.1.本发明中的复合微生物菌肥含有促生菌、固氮菌、产嗜铁素、解磷菌和解钾菌，以及高产acc脱氨酶促生菌等特性，能为植物提供所需的氮、磷、钾等全面的营养；
22.2.本发明中的复合微生物菌肥能够帮助植物吸收营养、刺激植物生长，增加植物抗逆性等；
23.3.本发明中的复合微生物菌肥能有效保护和改善土壤健康，具有农业发展的可持续性；
24.4.长远而言，本发明中的复合微生物菌肥能起到减肥增效的功效，减少n2o为主的温室气体，地下水体的富营养化等，从而构建环境友好型农业生态系统；
25.5.本发明的复合微生物菌肥与复合肥联用，能够显著提升植物的促生能力；复合微生物菌肥的添加，可以减少化学肥料对土壤造成富营养化危害的同时，达到化肥减量增效、绿色农业发展的目的。
附图说明
26.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
27.图1为实施例1中4株菌株的显微观察形态图(左)和电镜图(右)，其中显微观察形态图和电镜图的标尺均为2μm；
28.图2为实施例2中4株菌株的产嗜铁素能力定性检测图；
29.图3为效果验证中不同处理玉米幼苗株高、根长等生长指标；
30.图4为效果验证中不同处理的玉米幼苗茎粗、地上鲜重等生长指标；
31.图5为效果验证中不同处理的玉米幼苗的根系形态图。
具体实施方式
32.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
33.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
34.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
35.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多
种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
36.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
37.实施例1菌株的分离、鉴定
38.菌株的分离
39.从采集自山西省长治市振东道地药材股份有限公司的三年生苦参根际土壤分离筛选得到4株供试菌株。
40.菌株的形态特征及理化性质
41.参照《常见细菌系统鉴定手册》和《微生物学实验技术》，测定菌株的生理生化特征。对菌株进行淀粉水解试验、明胶液化试验、丙二酸盐试验、柠檬酸盐试验、甲基红试验、过氧化氢酶试验、伏普(v-p)试验、苯丙氨酸脱氨酶试验、尿素酶测定等试验。
42.参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏系统细菌学手册》，4株菌株均为革兰氏阳性菌，参照其形态学特征(如图1及表1所示)、生理生化特征(表2)和16srdna测序，鉴定菌株nif1-2为莫拉维假单胞菌(pseudomonasmoraviensis)，nif2-6为利尼假单胞菌(pseudomonas lini)，sip23-3为假单胞菌属(pseudomonas sp.)，以及sip23-7为不动杆菌属(acinetobacter sp.)。
43.将上述4株菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学；其中，莫拉维假单胞菌(pseudomonasmoraviensis)nif1-2，保藏编号为cctcc no：m 20211055，保藏日期为2021年8月23日；利尼假单胞菌(pseudomonas lini)nif2-6，保藏编号为cctcc no：m 20211057，保藏日期为2021年8月23；假单胞菌(pseudomonas sp.)sip23-3，保藏编号为cctcc no：m 20211153，保藏日期为2021年9月9日；不动杆菌(acinetobacter sp.)sip23-7，保藏编号为cctcc no：m 20211152，保藏日期为2021年9月9日。
44.表1各菌株的形态特征
[0045][0046]
表2各菌株的理化性质
[0047][0048]
各菌株16s rdna测序结果如下：
[0049]
nif1-216srdna序列如seq id no：1所示。
[0050]
seq id no：1：
[0051]
tttgcaggcgcagctaccatgcaagtcgagcggatgagaggagcttgctcctggattcagcggcggacgggtgagtaatgcctaggaatctgcctggtagtgggggacaacgtttcgaaaggaacgctaataccgcatacgtcctacgggagaaagcaggggaccttcgggccttgcgctatcagatgagcctaggtcggattagctagttggtgaggtaatggctcaccaaggcgacgatccgtaactggtctgagaggatgatcagtcacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgaaagcctgatccagccatgccgcgtgtgtgaagaaggtcttcggattgtaaagcactttaagttgggaggaagggttgtagattaatactctgcaattttgacgttaccgacagaataagcaccggctaactctgtgccagcagccgcggtaatacagagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcgcgtaggtggtttgttaagttggatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcatccaaaactggcaagctagagtatggtagagggtggtggaatttcctgtgtagcggtgaaaatgcgtagatataggaaggaacaccagtggcgaaggcgaccacctggactgatactgacactgagggtgcgaaagcgtggggagcaaaacgattatataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtaactagccgttgggatccttgagctctttgtggcgcagctttcgcattaattgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggccttgacatccaatgaactttccagagatggattggtgccttcgggaacattgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgtaacgagcgcaacccttgtccttagttaccagcacgttatggtgggcactctaaggagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacggcctgggctacacacgtgctacaatggtcggtacaaagggttgccaagccgcgaggtggagctaatcccataaaaccgatcgtagtccggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagtcggaatcgctagtaatcgcgaatcagaatgtcgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaccagaagtagctagtctaaccttcgggaggacggtaccacggtatgtggggttc.
[0052]
nif2-616srdna序列如seq id no：2所示。
[0053]
seq id no：2：
[0054]
acacatgcagtcgagcggcagcacgggtacttgtacctggtggcgagcggcggacgggtgagtaatgcctaggaatctgcctggtagtgggggataacgctcggaaacggacgctaataccgcatacgtcctacgggagaaagcaggggaccttcgggccttgcgctatcagatgagcctaggtcggattagctagttggtgaggtaatggctcaccaaggcgacgatccgtaactggtctgagaggatgatcagtcacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgaaagcctgatccagccatgccgcgtgtgtgaagaaggtcttcggattgtaaagcactttaagttgggaggaagggcagttacctaatacgtatctgttttgacgttaccgacagaataagcaccggctaactctgtgccagcagccgcggtaatacagagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcgcgtaggtggttcgttaagttggatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcattcaaaactgacgagctagagtatggtagagggtggtggaatttcctgtgtagcggtgaaatgcgtagatataggaaggaacaccagtggcgaaggcgaccacctggactgatactgacactgaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcaactagccgttgggagccttgagctcttagtggcgcagctaacgcattaagttgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggccttgacatccaatgaactttccagagatggattggtgccttcgggagcattgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgtaacgagcgcaacccttgtccttagttaccagcacgtaatggtgggcactctaaggagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacggcctgggctacacacgtgctacaatggtcggtacagagggttgccaagccgcgaggtggagctaatcccataaaaccgatcgtagtccggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagtcgg
aatcgctagtaatcgcgaatcagaatgtcgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaccagaagtagctagtctaaccttcgggaggacggtac.
[0055]
sip23-316srdna序列如seq id no：3所示。
[0056]
seq id no：3：
[0057]
cgcatgcggcagctacacatgcaagtcgagcggatgacgggagcttgctccttgattcagcggcggacgggtgagtaatgcctaggaatctgcctggtagtgggggacaacgtttcgaaaggaacgctaataccgcatacgtcctacgggagaaagcaggggaccttcgggccttgcgctatcagatgagcctaggtcggattagctagttggtgaggtaatggctcaccaaggcgacgatccgtaactggtctgagaggatgatcagtcacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgaaagcctgatccagccatgccgcgtgtgtgaagaaggtcttcggattgtaaagcactttaagttgggaggaagggcattaacctaatacgttagtgttttgacgttaccgacagaataagcaccggctaactctgtgccagcagccgcggtaatacagagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcgcgtaggtggtttgttaagttggatgtgaaagccccgggctcaacctgggaactgcatccaaaactggcaagctagagtacggtagagggtggtggaatttcctgtgtagcggtgaaatgcgtagatataggaaggaacaccagtggcgaaggcgaccacctggactgatactgacactgaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcaactagccgttggaatccttgagattttagtggcgcagctaacgcattaagttgaccgcctgggagtacggccgcaagttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggccttgacatgcagagaactttccagagatggattggtgccttcgggaactctgacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgtaacgagcgcaacccttgtccttagttaccagcacgttatggtgggcactctaaggagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacggcctgggctacacacgtgctacaatggtcggtacagagggttgccaagccgcgaggtggagctaatctcacaaaaccgatcgtagtccggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagtcggaatcgctagtaatcgcgaatcagaatgtcgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaccagaagtagctagtctaaccttcgggaggacggttaccacggtgattca
[0058]
nif23-716srdna序列如seq id no：4所示。
[0059]
seq id no：4：
[0060]
aatgttgagcttaccatgcaagtcgagcggggaaggttgcttcggtaactgacctagcggcggacgggtgagtaatgcttaggaatctgcctattagtgggggacaacgttccgaaaggaacgctaataccgcatacgccctacgggggaaagcaggggatcttcggaccttgcgctaatagatgagcctaagtcggattagctagttggtggggtaaaggcctaccaaggcgacgatctgtagcgggtctgagaggatgatccgccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcggaagcctgatccagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttttggttgtaaagcactttaagcgaggaggaggctcctttagttaatacctaaagagagtggacgttactcgcagaataagcaccggctaactctgtgccagcagccgcggtaatacagagggtgcgagcgttaatcggatttactgggcgtaaagcgtgcgtaggcggctttttaagtcggatgtgaaatccctgagcttaacttaggaattgcattcgatactggaaagctagagtatgggagaggatggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccgatggcgaaggcagccatctggcctaatactgacgctgaggtacgaaagcatggggagcaaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgatgtctactagccgttggggcctttgaggctttagtggcgcagctaacgcgataagtagaccgcctggggagtacggtcgcaagactaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctggccttgacatactaagaactttccagagatggattggtgccttcgggaacttagatacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgc
aacgagcgcaacccttttccttatttgccatcgggtaatgccgggaactttaaggatactgccagtgacaaactggaggaaggcggggacgacgtcaagtcatcatggcccttacggccagggctacacacgtgctacaatggtcggtacaaagggttgctacctcgcgagaggatgctaatctcaaaaagccgatcgtagtccggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagaatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtttgttgcaccagaagtaggtagtctaaccgcaaggaggacgctaccacggtgcccccac.
[0061]
实施例2菌株的促生能力测定
[0062]
2.1解磷能力测定
[0063]
分别挑取供试菌株点接于含有ca3(po4)2难溶性磷酸盐的蒙金娜固体培养基(葡萄糖10g，(nh4)2so40.5g，nacl 3g，kcl 0.3g，feso4·
7h2o 0.03g，mnso4·
h2o 0.03g，mgso4·
7h2o 0.3g，caco35g，酵母膏0.4g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，ph7.0-7.5；无机磷培养基：磷酸钙2g/100ml；有机磷培养基：卵磷脂0.2g/1000ml)平板上，37℃培养3-4d后观察解磷圈产生情况，记录并计算溶解磷圈直径和菌落直径的比值(d/d)。
[0064]
2.2产嗜铁素能力测定
[0065]
按1％的量接入到30ml液体mkb培养基中，在28℃、200r/min培养24h后，离心(10,000r/min，10℃)15min取上清液，与等体积cas蓝色检测液混匀。以不接菌的mkb培养液为对照。室温下充分1h后，测定样品(as)与对照(ar)od
630
的值，用如下公式计算铁载体产量：铁载体单位(％)＝(ar-as)/ar
×
100％
[0066]
2.3产iaa能力测定
[0067]
利用salkowki比色法分别对供试菌株产iaa能力进行定量测定，将供试细菌接种到king培养液(蛋白胨20g，k2hpo41.725g，丙三醇15ml，mgso4·
7h2o 1.5g，色氨酸0.1g，ph7.2)中，在28℃，120r/min条件下培养2天。再将菌株培养液在5000r/min离心3min，取上清液1ml加比色液(h2o 50ml，0.5mol/lfecl31ml，浓硫酸30ml)，在黑暗中静置30min，在530nm波长下测定od值，以iaa浓度为横坐标，od
530
为纵坐标作图，标准曲线进行测定。
[0068]
2.4固氮菌固氮酶活性
[0069]
采用乙炔还原法测定固氮酶活性。将供试菌株接种于lb培养基中，30℃恒温条件下培养8h后，在4℃下，5000r/min离心10min后收集菌液，用0.85％的生理盐水洗涤3遍，用无氮培养基重悬至od
600
＝1.0。将2ml菌种加入于20ml顶空瓶中，顶空瓶中加入5ml无氮培养基，用封口膜密封在30℃恒温条件下培养24h，再用无菌顶空瓶盖密封。用无菌注射器抽出2ml气体，再注入等体积乙炔，继续培养72h。抽取0.5ml气体进入气相色谱仪分析，测定样品乙烯的峰面积及乙烯含量。每种菌株设3个重复，根据标准乙炔气体的标准曲线得到菌株的固氮能力。固氮酶活性(nmol/mg
·
min)计算公式如下：
[0070]
固氮酶活性＝(所测菌株乙烯峰面积
×
瓶子上方体积)/(1nmol乙烯的峰面积
×
注入气体体积
×
菌体蛋白含量
×
反应时间)
[0071]
如表3所示，通过对促生能力包括解磷能力、解钾能力、嗜铁素能力、产iaa能力、及固氮菌的固氮酶活性进行测量，选取了4株促生能力比较强的菌株，其中包括高产iaa菌株nif1-2、nif2-6、固氮酶活性较高的菌株nif2-6及通过定性(图2)；解磷、解钾能力强的菌株sip23-7和sip23-3；皆具高解钾、高产acc脱氨酶菌株sip23-7，皆具固氮酶活性高及高产acc脱氨酶菌株sip23-7。这4株菌株nif1-2、nif2-6、sip23-3和sip23-7将作为优质菌株制作复合微生物菌肥。
[0072]
表3 6株供试菌株促生能力
[0073][0074]
实施例3复合微生物菌肥的制备
[0075]
分别挑取上述备选4株供试菌株单菌落接入5ml lb(蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化钠10g、蒸馏水1000ml、ph7.0)中，28℃，180rpm/min，过夜振荡培养；按照1％接种量从上述5ml过夜菌中接入50ml lb中继续二次振荡培养4h，测量od
600
，将od值稀释至0.5后，使其有效菌数达到108cfu/ml(依据国家标准《农用微生物菌剂》质量标准gb20287-2006)。在无菌条件下，将上述4种稀释菌液等体积混合得到混合菌液，即为复合微生物菌肥。
[0076]
效果验证
[0077]
供试植物：先玉335玉米种子(提前在30℃下催芽24h)。
[0078]
载体材料配方：草碳：珍珠岩：蛭石＝3：1：1，每份60g，置于灭菌锅中121℃，灭菌20min。
[0079]
复合肥：购自安徽六国化工股份有限公司，n-p2o
5-k2o 24-12-12，总养分≥48％。
[0080]
试验设计：试验设10个处理，每个处理设4个重复，按照尿素或复合肥分别按照为低量(3.75
×
10-4
g/cm2)和高量(7.5
×
10-4
g/cm2)的施用量平均分配到4个穴盘育苗盘中，具体处理如表4所示，表4中的复合微生物菌肥即为实施例3制备的复合微生物菌肥。实验植物放置于温室中统一管理，光照时间为12h/d，光照强度约为2000lux。
[0081]
表4复合微生物菌肥接种盆栽实验不同处理
[0082][0083]
玉米幼苗生长21d后，分别测量不同处理组的玉米幼苗株高、茎粗、叶面积、叶绿素及地上鲜重、地上干重、地下鲜重、地下干重、根长、根粗、根系活力等指标，结果见表5、图3、图4、图5。
[0084]
玉米种植21d后，采样测定玉米的生长指标，观察复合微生物菌肥对玉米的影响，
由表5的数据可知，发现与只浇无菌水的对照(ck)相比，添加了复合微生物菌肥的处理(mf)，株高增加了1.01％，叶面积增加了7.66％，而茎粗和叶绿素的差异不大；生长最好的是同时添加复合微生物菌肥和低量复合肥的处理(mf+lcf)，并且与ck和lcf形成明显的差异，株高分别增加了2.22％，茎粗增加了24.72％，叶绿素增加了27.94％，除叶面积低于只添加无菌水的对照(ck)外，mf+lcf处理组的株高增加了2.22％，茎粗增加了58.40％，叶绿素增加了16.77％。因此表明通过复合微生物菌肥促进了玉米地上部分的生长。
[0085]
表5不同处理的玉米幼苗生长指标
[0086][0087]
长期以来，化肥显著的增产效应，使人们在生产实践中往往只重视肥料养分的投入，全球化肥投入和作物产量增加的同时，因此，常常施肥过量，导致根系生长受阻、根际过程减弱、植物-微生物互作紊乱、根际微生态环境恶化，从而严重制约了养分效率的提高，土壤中氮淋失所造成的污染也随之日益加剧；实现作物高产、资源高效与环境保护的基础，也是国内外亟待突破的重大科学问题。
[0088]
本发明中在实施减少化肥的条件下，研制的复合微生物菌肥，含有固氮菌、产嗜铁素、解磷菌和解钾菌，以及高产acc脱氨酶等促生菌，能够补充植物生长所需的氮、磷、钾等营养物质，从而促进植物生长，提高作物抗旱能力，促进生根；补充的钾元素，使植物生长健壮，抑菌、抗倒伏能力提高等。通过对玉米的根和茎叶的鲜重及干重、根长、根粗、根系活力进行测定，结果如表5所示，同时添加复合微生物菌肥和低量复合肥的处理(mf+lcf)不仅比低量复合肥(lcf)的处理组在株高、根长、叶绿素含量及茎粗等生长指标有所促进，而与添加高量复合肥(hcf)的对照相比，其株高、根长、叶绿素含量、茎粗及根系鲜重的增加，增加值分别为2.98％、19.6％、28.39％、36.83％和4.25％，且说明仅凭提高化肥的量并不能促进植物生长，而添加一定的复合微生物菌肥可以促进植株的生长；而添加复合微生物菌肥和高量复合肥的处理(mf+hcf)与hcf处理组比较，仅茎粗和地上鲜重指标增加；同时可以看出，单独通过提高尿素的量(hu)并不一定能提高玉米的生长指标，配合复合微生物菌肥和高量尿素(mf+hu)能提高玉米的一些生长指标，如株高、茎粗和叶绿素含量；配施复合微生物菌肥和较低量尿素(mf+lu)的处理组相比较hu处理组，能显著提高玉米的某些生长指标，如：株高、叶面积、根长、叶绿素及茎粗，尤其随着复合微生物菌肥的添加，尤其mf+hcf处理组的根系形态构型可塑性强，侧根发达，细长、根毛多、根冠比大、根系总吸收面积和活跃吸收面积大等特点，增加了与土体的接触面积，增强土壤营养物质的吸收，为植株后期汲取土壤营养物质的运输提供了足够的条件。
[0089]
大多数植物的氮是从营养组织中输送而来，因此开花前对氮的摄取和同化对于营养器官的生长至关重要。当土壤中可利用的氮素缺乏时，根会相对于芽优先生长，以摄取更多的养分。因此在植物的营养生长时期，少量的氮素营养可以激活某些no
3-和nh
4+
转运蛋白的活化，同时更利于根的生长。
[0090]
综上所述，复合微生物菌肥和低量复合肥(mf+lcf)的是处理组玉米生长最好，株高、茎粗、叶绿素及地上鲜重、根系鲜重、根长等指标促生显著。即在减少适量复合肥的前提下，添加该复合微生物菌肥，玉米促生能力显著。复合微生物菌肥的添加，可以减少化学肥料对土壤造成富营养化危害的同时，能对土地的绿色土壤的生态文明建设，达到了化肥减量增效、绿色农业发展的目的。
[0091]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围。