抗SARS-CoV-2病毒N蛋白的结合抗体及其应用

本发明属于生物，具体涉及抗sars-cov-2病毒n蛋白的结合抗体及其应用。

背景技术：

1、新型肺炎(现称为covid-19)是由冠状病毒sars-cov-2引起的。covid-19患者多表现为发热、咳嗽等轻度或中度症状，重度患者可发展为急性呼吸窘迫综合征、急性心脏损伤、多器官衰竭和继发性感染。治愈的患者也会存在不可逆转的肺部纤维化，生殖系统和造血系统也会发生潜在损害。

2、sars-cov-2属于冠状病毒科正冠状病毒亚科β属sarbecovirus亚属，与严重急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus,sars-cov)、中东呼吸综合征冠状病毒(middle east respiratory syndrome coronavirus,mers-cov)属于同属的不同亚属。sars-cov-2单链核糖核酸基因组大小约为29.9kb，由11个基因组成，基因组按5′-复制酶(orf 1/ab)-结构蛋白[刺突蛋白(s)-包膜蛋白(e)-膜蛋白 (m)-核衣壳蛋白(n)]-3′的顺序排列。

3、包膜锚定的s蛋白能在感染的过程中附着宿主，s蛋白的胞外结构域有s1和s2 两个亚基，s1亚基与宿主细胞表面的受体结合，再通过s2亚基介导病毒膜和宿主膜融合。m蛋白可与核衣壳结合，在包膜的形成及装配过程中发挥作用。e蛋白主要负责病毒的组装和释放。n蛋白为核衣壳蛋白，与病毒rna基因组结合。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是如何识别新型冠状病毒的n蛋白和/或如何获得抗新型冠状病毒n蛋白的结合抗体。

2、为了解决上述技术问题，本发明首先提供了抗新型冠状病毒n蛋白的抗体。所述抗体为a或/和b。所述a可为单克隆抗体n2e5或其抗原结合部分和/或单克隆抗体 n8c6或其抗原结合部分。所述单克隆抗体n2e5或其抗原结合部分含有名称可为 n2e5-vh的重链可变区和名称为n2e5-vl的轻链可变区。所述n2e5-vh和n2e5-vl均由决定簇互补区和框架区组成。所述n2e5-vh和所述n2e5-vl的决定簇互补区均可由cdr1、cdr2和cdr3组成。

3、所述n2e5-vh的cdr1的氨基酸序列可为序列表中seq id no.1的第26-33位。

4、所述n2e5-vh的cdr2的氨基酸序列可为序列表中seq id no.1的第51-57位。

5、所述n2e5-vh的cdr3的氨基酸序列可为序列表中seq id no.1的第96-110位。

6、所述n2e5-vl的cdr1的氨基酸序列可为序列表中seq id no.2的第26-31位。

7、所述n2e5-vl的cdr2的氨基酸序列可为序列表中seq id no.2的第49-51位。

8、所述n2e5-vl的cdr3的氨基酸序列可为序列表中seq id no.2的第88-98位。

9、所述b可为单克隆抗体n8c6或其抗原结合部分。所述单克隆抗体n8c6或其抗原结合部分可含有名称为n8c6-vh的重链可变区和名称为n8c6-vl的轻链可变区。所述n8c6-vh和n8c6-vl均由决定簇互补区和框架区组成。所述n8c6-vh和所述 n8c6-vl的决定簇互补区均由cdr1、cdr2和cdr3组成。

10、所述n8c6-vh的cdr1的氨基酸序列可为序列表中seq id no.5的第26-33位；

11、所述n8c6-vh的cdr2的氨基酸序列可为序列表中seq id no.5的第51-58位；

12、所述n8c6-vh的cdr3的氨基酸序列可为序列表中seq id no.5的第97-107位；

13、所述n8c6-vl的cdr1的氨基酸序列可为序列表中seq id no.6的第26-34位；

14、所述n8c6-vl的cdr2的氨基酸序列可为序列表中seq id no.6的第52-54位；

15、所述n8c6-vl的cdr3的氨基酸序列可为序列表中seq id no.6的第91-101位。

16、上述抗体中，所述单克隆抗体n2e5的重链可变区的氨基酸序列可为序列表中 seqid no.1或与seq id no.1具有至少80％的同一性。所述单克隆抗体n2e5的轻链可变区的氨基酸序列可为序列表中seq id no.2或与seq id no.2具有至少80％的同一性。其中，氨基酸序列的不一致处可在框架区(fr)。

17、所述单克隆抗体n8c6的重链可变区的氨基酸序列可为序列表中seq id no.5或与seq id no.5具有至少80％的同一性。所述单克隆抗体n8c6的轻链可变区的氨基酸序列可为序列表中seq id no.6或与seq id no.6具有至少80％的同一性。其中，氨基酸序列的不一致处可在框架区(fr)。

18、上述至少80％的同一性，可为至少80％、85％或95％的同一性。

19、本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有 filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

20、本文中，所述至少80％的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或 99％的同一性。

21、具有改善的亲和力和/或效价的本发明所述抗体的变体可通过采用在本领域已知的方法来获得，并包括在本发明的范围内。例如，氨基酸置换可用于获得具有进一步改善的亲合力的抗体。或者，核苷酸序列的密码子优化也可用来改善用于产生抗体的表达系统中的翻译效率。此外，包含通过对本发明的任何核酸序列应用定向进化法而优化抗体特异性或中和活性的序列的多核苷酸也属于本发明的范围内。

22、上述抗体中，所述单克隆抗体可为下述任一种：

23、a)单链抗体；

24、b)含有a)所述单链抗体的融合抗体；

25、c)fab片段；

26、d)fv片段；

27、术语“fab片段”是由重链fd和完整轻链通过二硫键结合而成的异二聚体，仅含一个抗原结合位点。将重链fd和完整轻链的编码基因连接，融合细菌蛋白信号肽基因后可在大肠杆菌内分泌表达fab抗体(fab片段)，并有完整的立体折叠和链内、链间二硫键。所述重链fd指fab中约1/2的h链部分(约含225个氨基酸残基，包括vh、 ch1和部分铰链区)。

28、术语“fv片段”是指可分别构建含有vh和vl基因的载体，共转染细胞，使之分别表达，再组装成功能性fv抗体；也可在载体中的vh和vl之间设置终止密码，分别表达两个小分子蛋白片段，再通过非共价键结合而形成fv抗体(fv片段)。

29、术语“fab′片段”含有一条轻链和包含vh结构域和ch1结构域以及ch1和ch2 结构域之间区域的一条重链的部分，由此可在两个fab′片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成f(ab′)2分子。

30、术语“f(ab′)2片段”含有两条轻链和两条包含ch1和ch2结构域之间的恒定区的部分的重链，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，f(ab′)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个fab′片段组成。

31、术语“单链抗体(scfv)”是指用适当的寡核苷酸接头(linker)连接轻链和重链可变区基因，使之表达单一的多肽链，称为单链抗体(scfv)。多肽链能自发折叠成天然构想，保持fv的特异性和亲和力。

32、术语“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体(parental antibody)的抗原结合区或可变区(例如一个或多个cdr)。所述抗原结合片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。通常，当基于摩尔来表示活性时，所述抗原结合片段保留至少10％的母体结合活性。具体地，所述抗原结合片段保留至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更多的母体抗体对靶标的结合亲和力。

33、术语“纳米抗体(单域抗体)”是指将抗体重链v区通过基因工程方法表达，获得仅含vh片段的抗体。单域抗体与抗原结合的能力及其稳定性，与完全抗体基本一致。

34、术语“双特异性抗体”是指将两套轻链、重链基因导入骨髓瘤细胞中，选择合适的抗体恒定区及ig类型，可获得产量大、均一性和纯度高的双特异性抗体。另外，以化学交联技术或杂交-杂交瘤技术也可获得双特异性抗体。

35、术语“最小识别单位(mru)”是指仅含可变区中单一cdr结构，分子质量仅为完整抗体的1％左右，可结合相应抗原。

36、本发明的抗体可以本领域已知的各种方法来制备，例如通过基因工程重组技术来获得。例如，通过化学合成或pcr扩增获得编码本发明抗体的重链和轻链基因的dna 分子。将所得dna分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞，在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本发明的抗体。

37、本领域技术人员熟知，所述抗原结合片段可以可通过重组dna技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。

38、为了解决上述技术问题，本发明还提供了编码上文所述的单克隆抗体n2e5或其抗原结合部分的核酸分子和/或上文所述的单克隆抗体n8c6或其抗原结合部分的核酸分子。

39、所述核酸分子可为如下c1)或c2)或c3)所述的dna分子：

40、c1)单克隆抗体的编码dna分子，所述单克隆抗体的重链可变区编码序列可为序列如seq id no.3所示的dna分子，所述单克隆抗体的轻链可变区的序列如seq id no.4所示的dna分子。

41、c2)单克隆抗体的编码dna分子；所述单克隆抗体的重链可变区编码序列为序列如seq id no.7所示的dna分子，所述单克隆抗体的轻链可变区的序列如seq id no.8所示的dna分子。

42、c3)与c1)或c2)限定的dna分子具有90％以上的同一性且编码所述单克隆抗体或其抗原结合部分的dna。

43、本文中，所述至少90％的同一性可为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

44、为了解决上述技术问题，本发明还提供了生物材料。所述生物材料可为含有上文所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物和/或重组动物细胞系。

45、本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或m13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、病毒载体(如杆状病毒载体、逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒或疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)等)。在本发明的一个实施例中，载体具体可为padscfv-s载体或pcdna3.1(+)载体。

46、本文所述微生物可为酵母、细菌或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(escherichia),欧文氏菌(erwinia),根癌农杆菌属(agrobacterium)、黄杆菌属(flavobacterium),产碱菌属(alcaligenes),假单胞菌属(pseudomonas),芽胞杆菌属(bacillus)等；酵母可为毕赤酵母(p.pastoris)。

47、所述细胞系(宿主细胞)是指可用于导入载体的细胞，其包括但不限于：真核细胞(如酵母细胞、曲霉菌)、动物细胞(如哺乳动物细胞、昆虫细胞)或原核细胞。在本发明的一个实施例中，所述细胞系具体可为hek293-f细胞。

48、术语“细胞”和“细胞系”可互换使用，并且所有这类名称都包括其后代。

49、上文所述的抗体在检测新型冠状病毒n蛋白中的应用也属于本发明的保护范围。

50、为了解决上述技术问题，本发明还提供了上文所述抗体和/或上文所述生物材料在制备检测或诊断新型冠状病毒的产品中的应用。

51、为了解决上述技术问题，本发明还提供了上文所述抗体和/或上文所述生物材料在制备或开发新型冠状病毒临床治疗的产品中的应用。

52、为了解决上述技术问题，本发明还提供了上文所述抗体和/或上文所述生物材料在制备或开发新型冠状病毒所致疾病的药物中的应用。

53、为了解决上述技术问题，本发明还提供了上文所述抗体和/或上文所述生物材料在制备检测或诊断新型冠状病毒所致疾病的产品中的应用。

54、本发明的筛选获得了2种抗新型冠状病毒核衣壳蛋白(nucleocapsid，n蛋白，sars-cov-2n蛋白)的新结合抗体，所述单克隆抗体n2e5和n8c6能识别新型冠状病毒n蛋白，所述单链抗体包括重链可变区和轻链可变区。所述n2e5重链可变区具有如seq id no.1的第26-33位、第51-57位和第96-110位所示的氨基酸序列的三个互补决定区；所述n2e5轻链可变区具有如seq id no.2的第26-31位、第49-51位和第88-98位所示的氨基酸序列的三个互补决定区。所述n8c6重链可变区具有如seq id no.5的第26-33位、第51-58位和第97-107位所示的氨基酸序列的三个互补决定区；所述n8c6轻链可变区具有如seq id no.6的第26-34位、第52-54位和第91-101 位所示的氨基酸序列的三个互补决定区。

55、本发明的有益效果在于：

56、本发明提供的抗sars-cov-2病毒n蛋白的单链抗体可以特异性识别 sars-cov-2病毒n蛋白，所述n2e5和n8c6单克隆抗体与n蛋白的动力学常数 kd分别为1.42×10-8m和1.31×10-8m。

57、该抗体与新型冠状病毒的n蛋白亲和力高，可以广泛用于新冠病毒检测、临床治疗等。