C1型肉毒毒素轻链突变体及其应用

本发明属于医药，提供的c1型肉毒毒素轻链突变体：53f、53l、52h53y、51d52h53y、51s52h53y、51g52h53y、51a52h52y、51y52h53y、51f52h53y等及其替换c1型肉毒毒素轻链部分或者与穿膜肽融合，可在以将全长肉毒毒素作为载体制备神经系统给药靶向递送药物，或在制备对a型肉毒毒素响应或不响应的医美产品及相关药物，或在制备syntaxin介导的高分泌疾病药物中的应用。

背景技术：

1、肉毒毒素(botulinum neurotoxins，bonts)是厌氧芽孢杆菌肉毒杆菌在繁殖过程中产生的细菌外毒素，根据免疫原性的不同，可分为a-g七种血清型。七种血清型在序列和结构上高度相似，其活性形式是由50kda的轻链和100kda的重链组成经二硫键连接的150kda的二聚体。该二聚体具有3个重要的功能域：重链受体结构域(hcc)，识别并结合神经元细胞表面的受体，通过受体介导的内吞作用进入细胞；重链易位结构域(hcn)，在内吞体酸性环境下，肉毒毒素的构象发生变化，hcn在内吞体膜上形成一个蛋白质传输通道，将轻链递送到细胞质；轻链(lc)域具有锌金属蛋白酶活性，在靶神经元细胞的胞浆中，lc特异性切割可溶性n-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(snares)复合物。snare蛋白复合物能够促进突触囊泡膜和细胞膜融合，肉毒素lc切割snares后会阻断突触囊泡膜和细胞膜的融合，从而抑制神经递质的释放，最终导致肌肉弛缓性麻痹[1]。snare蛋白复合物由两个25kda的突触体相关蛋白(snap-25)蛋白、一个syntaxin-1蛋白、一个vamp2蛋白构成。不同血清型的肉毒毒素的底物不同：bont/a、bont/c和bont/e切割snap-25；其中bont/b、bont/d、bont/f、bont/g切割vamp(也称为synaptobrevin)/vesicle-associated membraneprotein isoforms 1、2、3；bont/c除了可以切割snap-25，同时还可以切割syntaxin-1、2、3[2]。

2、目前，临床上批准了肉毒毒素bont/a和bont/b的应用。其中，bont/a应用最为广泛，bont/a最初被批准用于眼睑痉挛、面肌痉挛和斜视的治疗，现应用范围不断扩大，包括各种神经肌肉疾病、自主神经和其他非神经元疾病[3]。随着bont/a的临床应用越来越广，部分患者对这种血清型的毒素不响应或者在长期治疗后由于特异性免疫反应而产生耐药性，从而导致bont/a无效[4]。bont/b在某些方面的应用优于bont/a，但是，bont/b与靶细胞受体结合的亲和性低，导致bont/b在注射部位吸收不好，易扩散也必须应用更高剂量的毒素才能达到应用低剂量bont/a时所获得的治疗效果，这导致非靶毒性显著增加，其不良反应发生率比bont/a要高。事实上，bont/b的临床应用极为有限[5]。

3、肉毒毒素减少突触传递引起神经肌肉接头麻痹失能后，随着进入细胞内毒素轻链的降解和细胞内snare蛋白的重新合成，肌肉可完全恢复功能。bont/a一般可持续2-4个月之久，因此，是一个长效型毒素。其他血清型的毒素虽然能有效引起神经肌肉接头麻痹，但通常较迅速地就完全恢复了功能。除bont/a以外，bont/c是与之作用持续性相差无几的另一个长效型肉毒毒素[6]。而且，bont/c还是唯一一个可以切割两种不同snare蛋白的肉毒毒素。针对患者反复应用bont/a后产生的无响应耐药，bont/c是一个极有潜力的选择。但是，bont/c也切割bont/a的底物snap-25，这限制了bont/c替代bont/a策略的实施。

4、bont/c具有3种亚型，称为血清型cl、c2和c3。c1神经毒素通过阻断由神经元释放的乙酰胆碱以低剂量使人和动物瘫痪，恢复很慢-治疗可能需要多周的机械通气才能使人能够再次呼吸。c2毒素不具有神经活性，而导致坏死和出血，c3毒素则少有研究报道[7]。因此，在未特别指明bont/c亚型的情况下，文献中检索到的bont/c通常理解为bont/c1。

5、jackson和wang于2014年在专利中公开了突变bont/c1轻链催化活性中心s1口袋处的氨基酸或者突变轻链和底物结合区的53-51位氨基酸，可以改变bont/c1 lc对底物syntaxin-1或snap-25切割的特异性及切割活性。该专利公开的底物特异性显著提高的bont/c1轻链突变体bont/c1α-51，仅保留了对syntaxin-1的切割活性，对snap-25的切割活性在他们公开的发明中已检测不到[8]。遗憾的是，bont/c1α-51被证明对syntaxin-1切割活性有所下降，残留了bont/c1野生型轻链50分之一到100分之一的snap-25切割活性[9]。研究表明，对底物snap-25和syntaxin-1的切割活性是bont/c1诱导神经元凋亡退化致肌肉麻痹的原因[10]。对于bont/c1而言，较低浓度时就可以切割syntaxin-1，浓度较高时才开始切割snap-25[9]。显而易见，获得比bont/c1α-51切割活性更强的突变体，可显著提高bont/c1突变体在临床上的应用潜力。

6、本发明采用定点突变方法对bont/c1α-51进行突变改造，旨在提供对syntaxin-1切割活性显著提高的bont/c1 lc突变体，从而克服上述bont/c1α-51存在的缺陷。

7、此外，研究报道syntaxin-1在ca2+触发的神经元突触囊泡和内分泌细胞致密核心囊泡的胞吐中至关重要，syntaxin-1a的裂解显著减少了胞吐。除了胞吐外，syntaxin-1还有许多其他功能，包括调节k+通道，ca2+通道和k-atp通道，其中k-atp通道在ii型糖尿病治疗中非常重要，syntaxin-1的裂解会增加k-atp通道的活性，从而减少β细胞的激活，恢复正常的胰岛素分泌[11]。bont/c1具有切割syntaxin-1的活性，将其轻链突变后，去除其snap-25切割活性，可用于涉及syntaxin介导的高分泌疾病的治疗。本发明拟采用基因工程手段对c1型肉毒毒素轻链进行突变改造，使bont/c1仅对syntaxin-1具有切割活性，最终令其有望用于在制备syntaxin介导的高分泌疾病药物中的应用。

8、肉毒素bonts能够以运动神经元为靶标，将其轻链运送到神经元中。因此它们可充当药物载体，将其运送到神经元中。但是，bonts要想成为一种传递工具，必须先“解毒”。如果简单删除毒素lc通常会造成毒素溶解性下降，而通过突变关键氨基酸残基来消除lc蛋白酶的活性[12]。本发明通过突变bont/c1α-51轻链53-51位氨基酸获得相应失活突变体，可以用于作为载体制备神经系统给药靶向递送药物应用。而且，由于bont/a的神经元细胞膜上受体为sv2，而bont/c1的受体至今尚未找到。相对于bont/a，bont/c1有不同的结合受体，显然，本发明获得的bont/c1失活突变体用作药物载体，有潜力将药物递送至与bont/a失活突变体用作药物载体时可抵达的不同的细胞和组织[7]。

9、本发明利用定点突变的方法得到的c1型肉毒毒素突变体，并在细胞水平检测这些突变体对底物snap-25、syntaxin-1的切割活性，本发明获得了仅对syntaxin-1有活性，对snap-25无活性c1型肉毒毒素轻链突变体，对syntaxin-1和snap-25均无活性的c1型肉毒毒素轻链突变体。本发明公开的c1型肉毒毒素轻链突变体，可替换c1型肉毒毒素轻链部分，在以将全长肉毒毒素作为载体制备神经系统给药靶向递送药物，或在制备对a型肉毒毒素不响应的医美产品及相关药物，或在制备syntaxin介导的高分泌疾病药物中应用。

10、参考文献

11、[1]vazquez-cintron e j,beske p h,tenezaca l,et al.engineeringbotulinum neurotoxin c1as a molecular vehicle for intra-neuronal drugdelivery[j].scientific reports,2017,7:42923.

12、[2]dong m,masuyer g,stenmark p.botulinum and tetanus neurotoxins[j].annual review of biochemistry.2019,88:811-837.

13、[3]胡平,陈平.a型肉毒毒素在前列腺疾病中的作用及机制研究进展[j].医学综述,2021,27(08):1556-61.

14、[4]eleopra r,tugnoli v,quatrale r,et al.clinical use of non-abotulinum toxins:botulinum toxin type c and botulinum toxin type f[j].neurotoxicity research,2006,9(2-3):127-31.

15、[5]tao l,peng l,berntsson rp,et al.engineered botulinum neurotoxin bwith improved efficacy for targeting human receptors[j].naturecommunications.2017,3；8(1):53.

16、[6]rossetto o,seveso m,caccin p,schiavo g,montecucco c.tetanus andbotulinum neurotoxins:turning bad guys into good by research[j].toxicon.2001；39(1):27-41.

17、[7]本杰明·j·帕弗里克，保罗·布卢姆，凯文·范·科特.适用于将分子递送进入选定细胞的工程改造的肉毒梭菌毒素[p].cn201680041056.9 2016-05-14.

18、[8]jackson mb,wang ds.engineered botulinum neurotoxin c1 withselective substrate specificity[p].us8853360b2 oct.7,2014.

19、[9]zanetti g,sikorra s,rummel a,et al.botulinum neurotoxin c mutantsreveal different effects of syntaxin or snap-25proteolysis on neuromusculartransmission.plos pathog.2017；13(8):e1006567.

20、[10]peng l,liu h,ruan h,et al.cytotoxicity of botulinum neurotoxinsreveals a direct role of syntaxin 1and snap-25in neuron survival.natcommun.2013；4:1472.

21、[11]wang d,zhang z,dong m,et al.syntaxin requirement for ca2+-triggered exocytosis in neurons and endocrine cells demonstrated with anengineered neurotoxin[j].biochemistry,2011,50(14):2711-3.

22、[12]miyashita s i,zhang j,zhang s,et al.delivery of single-domainantibodies into neurons using a chimeric toxin-based platform is therapeuticin mouse models of botulism[j].science translational medicine,2021,13(575):eaaz4197.

技术实现思路

1、本发明目的是提供一种bont/c1突变体及其在制备相关疾病药物中的应用。

2、本发明采用定点突变技术对bont/c1α-51的53-51位氨基酸从53位起，逐一替换为其他19种氨基酸，从每轮突变体中选择目标活性突变体，再进行下一轮突变。每轮突变中随机挑取定点突变后转化板上生长的3-5个克隆，提取质粒，外协委托金唯智公司进行测序，测序结果比对与理论突变序列吻合后，将保存的菌种复苏培养，采用大提试剂盒提取无内毒素质粒，以hek293t为包装细胞，进行病毒包装，包装48hr后，采用超速离心法收集病毒，采用包装的病毒感染pc12细胞，48hr，裂解细胞提蛋白，采用western blot分别检测本发明所获得的bont/c1 lc突变体切割底物snap-25和syntaxin-1的活性。同时，以bont/c1α-51和野生型轻链(bont/c1 lc wt)为阳性对照进行比较研究。

3、本发明涉及bont/c1 lc突变体的优化改造及其应用。本发明以bont/c1α-51为模板，采用定点突变的方式对bont/c1α-51的53至51位氨基酸依次进行将其替换为其他氨基酸，获得了44种突变体，并对获得突变体进行细胞水平酶切活性检测，评价它们对底物snap-25和syntaxin-1的切割活性，结果表明：bont/c1 lc突变体53t、53a、53f、53l、53h、53g、53e和52y53y对snap-25保留较弱的切割活性，对syntaxin-1切割活性显著优于bont/c1α-51。优选地，bont/c1 lc突变体52h53y、52q53y、51k52h53y、51w52h53y、51p52h53y、51d52h53y、51r52h53y、51a52h53y、51e52h53y、51g52h53y、51y52h53y和51s52h53y对snap-25无切割活性，对syntaxin-1切割活性显著优于bont/c1α-51。最后，bont/c1 lc突变体53w、52i53y和51f52h53y对底物snap-25和syntaxin-1均无切割活性。

4、本发明提供的对syntaxin-1切割活性显著高于bont/c1α-51的bont/c1 lc突变体，它们可替换全长bont/c1肉毒毒素的轻链部分，可在制备对a型肉毒毒素不响应的医美产品及相关抗肌张力障碍的药物中应用。本发明提供的对syntaxin-1的切割活性显著高于bont/c1α-51，对snap-25无切割活性的bont/c1 lc突变体，它们可替换全长bont/c1肉毒毒素的轻链部分，可在syntaxin介导的高分泌疾病的药物中应用。本发明提供的对底物snap-25和syntaxin-1均无切割活性的bont/c1 lc突变体，它们可替换全长bont/c1肉毒毒素的轻链部分，在以将全长肉毒毒素作为载体制备神经系统给药靶向递送药物中应用。

5、此外，如果采用基因工程重组技术在本发明提供的bont/c1 lc突变体的n端或c端引入穿膜肽，如tat等，在相应穿膜肽的作用下，可以引导本发明提供的bont/c1 lc突变体进入相应细胞或组织，发挥切割相应底物的作用。或者，借助脂质体等包装本发明提供的bont/c1 lc突变体，使其易于进入相应的细胞或组织，发挥切割相应底物的作用，从而纠正与细胞内囊泡过度分泌引起的相关疾病，这是本领域技术人员可以理解的。

6、下面结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下实施例。