GDF15基因甲基化检测方法

本发明涉及生物检测，具体为gdf15基因甲基化检测方法。

背景技术：

1、生长分化因子15是一种内分泌激素，是转化生长因子β超家族成员，与胶质细胞源性神经营养因子家族受体α样－转染重排异源二聚体受体结合而发挥作用，gdf15主要参与器官生长、分化、发育及细胞修复，在生理条件下，gdf15在除胎盘以外的其他组织中表达均较低；而在炎症或外伤应激等病理情况下，如存在多种刺激因素、肿瘤坏死因子－α等时，gdf15表达上调，大量研究表明，gdf15水平升高与心血管疾病如心肌肥大、心力衰竭、动脉粥样硬化、内皮功能障碍，以及肥胖症、糖尿病、癌症、恶液质等有关，已被证实是上述疾病诊断、进展或预后的新型生物标志物。

2、针对生物标志物，目前常见的检测方法包括基于dna水平的拷贝数检测，基于mrna水平的荧光定量检测，基于蛋白水平的免疫组化检测，表观修饰作为基因表达水平的重要调控机制，通过对基因的甲基化修饰来调节靶基因在不同组织类型，不同生理病理状态下的表达水平，近年来，dna甲基化修饰在基础医学研究和临床检测方面受到越来越多的重视，尤其是在肿瘤早筛早诊方面，目前已有结肠癌，胃癌基因甲基化检测试剂盒在国内获批用于相应肿瘤的早筛早诊，通过对靶基因甲基化状态的检测，来判断受检者罹患结肠癌或胃癌的风险。

3、目前针对gdf15生物标志物的检测，主要集中在蛋白水平的检测，蛋白水平的变化，是dna水平，转录水平，翻译水平多重调控机制综合作用的结果，尽管预警程度优先于形态学变化，但仍落后于其上游调控机制的变化，基因表观修饰水平的变化，直接影响众多基因的转录活性，属于转录调控机制的上游，通过对基因甲基化状态的检测，可以更早的发现基因表达水平的变化，能早期发现相应标志物的表达趋势，进而对疾病状态做出相应的预测。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供gdf15基因甲基化检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：gdf15基因甲基化检测方法，包括以下步骤：步骤一，引物设计；步骤二，样本收集；步骤三，核酸提取；步骤四，亚硫酸氢盐转化；步骤五，甲基化检测；

3、其中在上述步骤一中，首先选取gdf15基因chr 19:18,387,170-18,389,169(grch38)位置序列输入网址进行cpg岛甲基化修饰预测，以得到的转化序列作为模板，设计覆盖gdf15基因甲基化检测的特异性引物，设计4组引物对；

4、其中在上述步骤二中，当步骤一中的引物对设计完成后，利用100ml的采样杯采集适量待测的尿液备用；

5、其中在上述步骤三中，核酸提取包括以下步骤：

6、1)将步骤二中采集的尿液分入两根离心管，分别做上标记，配平后利用离心机进行离心，在4000g下离心10min；

7、2)离心完成后将离心管从离心机中取出，拧开盖子后小心移除上清，留存1-2ml尿液，加入10ml 1x pbs溶液，用1ml移液器吹打重悬沉淀，配平后离心4000g，离心10min；

8、3)离心完成后，拧开盖子后用移液器小心移除上清，加入1.5ml 1x pbs溶液，重悬沉淀，转移到1.5ml离心管中，标记好后放入台式离心机，4000g离心10min；

9、4)取出离心管，移除上清，留下沉淀，随后向沉淀中加入220μl pbs，10μl rnasesolution和20μl proteinase k，重悬细胞，常温静置一段时间；

10、5)加入250μl buffer gb至细胞悬液中，涡旋混匀，在金属浴65℃600rpm放置15min；

11、6)加入180μl无水乙醇至消化液中，涡旋混匀15sec；

12、7)将gdna columns吸附柱置于collection tubes收集管中，将上一步所得混合液转移到收集柱中，12000rpm，离心1min；

13、8)弃滤液，将吸附柱置于收集管中，加入500μlwashing buffer a至吸附柱中，12000rpm，离心1min；

14、9)弃滤液，将吸附柱置于收集管中，加入650μlwashing buffer b至吸附柱中，12000rpm，离心1min，

15、10)随即重复9)的操作；

16、11)将吸附柱置于收集管中，12000rpm，空管离心2min；

17、12)将吸附柱置于新的1.5ml离心管中，管盖做好标记，开盖室温放置2min；

18、13)加入50μl预热至70℃的elution buffer至吸附柱膜中央，闭盖后室温放置3min，12000rpm，离心1min；

19、14)弃掉吸附柱，取1μl用qubit4.0进行核酸浓度测定，记录浓度，取2μl用nanodrop进行纯度测定和浓度测定，要求od260/280在1.8-1.9区间，从而完成核酸的提取，提取的核酸备用；

20、其中在上述步骤四中，当步骤三中的核酸提取完成后，进行亚硫酸氢盐转化，步骤包括：

21、1)配制ct conversion mix：取一管ct conversion powder，12000rpm离心2min，加入1ml无核酸酶水，200μl ct conversion diluent，100μlct conversion buffer，震荡混匀，期间注意防止液体遗洒，确保粉末完全溶解；

22、2)在200μl灭菌pcr管中配制如下反应：

23、input dna xμl 100pg-2μg

24、ct conversion mix 130μl

25、nuclease free water to 150μl

26、混匀后取75μl转移到另外一个200μl灭菌pcr管中，震荡混匀后瞬时离心；

27、3)将pcr管置于pcr仪中，进行反应，反应完成后备用；

28、4)将epiart dna columns吸附柱置于collection tubes中，做好标记；

29、5)加入600μl e-binding buffer至吸附柱中，然后将转化产物加入吸附柱中，闭盖，颠倒混匀8-10次，使反应液与e-binding buffer完全混匀；

30、6)12000rpm，离心1min，弃滤液，将吸附柱重新放回收集管中；

31、8)加入500μl e-wash buffer至吸附柱中，12000rpm，离心1min，弃滤液，将吸附柱置于收集管中；

32、8)加入500μl e-desulphonation buffer至吸附柱中，闭盖后室温放置15min，12000rpm，离心1min，弃滤液，将吸附柱置于收集管中；

33、9)加入500μl e-wash buffer至吸附柱中，12000rpm，离心1min；

34、10)重复上述步骤9)；

35、11)弃滤液，将吸附柱置于收集管中，12000rpm，空管离心2min；

36、12)将吸附柱置于新的1.5ml离心管中，管盖做好标记，开盖室温放置2min；

37、13)加入20μle-elution buffer至吸附柱膜中央，闭盖后室温放置2min，12000rpm，离心2min；

38、14)弃掉吸附柱，取1μl用qubit4.0进行核酸浓度测定，记录浓度，其余样本放在－20℃冻存或4℃备用，从而制成转化后的dna模板备用；

39、其中在上述步骤五中，当步骤四中的亚硫酸氢盐转化完成后，进行gdf15基因甲基化序列检测，步骤如下：

40、1)稀释冻干引物至100μm，将引物对分装成10μm的工作液；

41、2)配制反应体系：4组引物分别进行扩增，同时设置阳性对照和阴性对照，阳性对照为商品化的人hct116细胞基因组亚硫酸氢盐转化模板，阴性对照为健康人血细胞基因组亚硫酸氢盐转化模板；

42、3)选取12.5μl的2x epiart hs taq master mix、2μl的引物、9.5μl的无核酸酶水、1μl的转化后的dna模版进行pcr扩增；

43、4)扩增完成后进行电泳检测，然后用凝胶成像系统观察电泳结果，并记录结果。

44、优选的，所述步骤一中，四组引物对分别为：

45、1)gdf-f1，正向序列aggcgttcgcgttgtatttg，gdf-r1，反向序列cacctcccgtaacgacaaca；

46、2)gdf-f2，正向序列gtcgtcgtcgtggtgagatt，gdf-r2，反向序列cccctaacgacttacgaccg；

47、3)gdf-f3，正向序列tatgtgtatcggcgcgtgtt，gdf-r3，反向序列ccatcaaaccaacccccgaa；

48、4)gdf-f4，正向序列cggcggttatttgtatttgc，gdf-r4，反向序列ccctaacgacttacgaccgc；

49、优选的，所述步骤三中，静置的时间为15-20min。

50、优选的，所述步骤四中，pcr仪中的反应为：98℃下反应10min，随后64℃下反应40min，随即98℃下反应5min，然后64℃下反应40min，随即98℃下反应5min；继而64℃下反应40min，随后4℃下hold，最后热盖105℃。

51、优选的，所述步骤五中，扩增的程序为：95℃下扩增5min，随后95℃扩增30sec、57℃扩增30sec和72℃扩增30sec为一个循环，循环35次，完成后72℃下扩增5min，12℃下hold，最后热盖105℃。

52、优选的，所述步骤五中，电泳的条件为：配制2％琼脂糖凝胶，使用1x tae缓冲液进行电泳，100bp dna ladder作为分子量marker，150v电压恒压20min。

53、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

54、1.本发明采用耐u特异性taq酶进行pcr扩增，避免了普通taq酶和高保真taq酶与亚硫酸氢盐转化过程中大量未甲基化的c转变为u，造成无法pcr扩增的情况出现；

55、2.本发明利用以亚硫酸氢盐转化产物为模板，分别测试不同退火温度下的pcr扩增情况，温度梯度为55℃，56℃，57℃，58℃，59℃，60℃，61℃，62℃，工艺设计和高效，保证适宜的反应温度，提升了反应效率；

56、3.本发明的方法科学，对于gdf15基因甲基化修饰的实验流程合理高效，对不同浓度的引物进行测试，得出0.4μm浓度的时候的gdf15-f4/r4引物对的扩增效果最好，pcr产物条带最亮，有利于保证引物对的合理选择。