适体动态范围压缩和检测技术的制作方法

背景技术：

1、所公开的技术整体涉及用于与基于适体的测定结合的动态范围压缩的适体检测和/或鉴定技术。具体地，所公开的技术涉及用于与基于适体的测定结合的直接或间接适体检测的核酸测序。

2、本部分中讨论的主题不应仅因为在本部分中有提及就被认为是现有技术。类似地，在本部分中提及的或与作为背景技术提供的主题相关联的问题不应被认为先前在现有技术中已被认识到。本部分中的主题仅表示不同的方法，这些方法本身也可对应于受权利要求书保护的技术的具体实施。

3、蛋白质表达模式有助于定义细胞的身份和状态。rna转录物通常用作蛋白质表达的替代物，但是蛋白质的丰度与mrna之间的关系不是一对一的。存在由转录后、翻译和蛋白质降解的调节引起的差异。因此，对rna转录物进行直接核酸测序可能不能准确估计蛋白质表达。

4、适体是以高亲和力和特异性与分子靶标(诸如蛋白质)结合的核酸。适体选择和设计方面的进步包括指数富集的配体系统进化(selex)。在selex中，可以从组合文库中分离不同感兴趣分析物的高亲和性核酸，从而允许对适体-靶标结合进行高通量表征并对复杂生物样品中的分析物进行多重测定。在适体与分析物靶标结合后，可以检测结合事件以表征生物样品中各种分析物的存在和浓度。然而，因为不同生物样品内和/或不同生物样品之间的蛋白质或其他分析物浓度可能有很大程度的变化，所以鉴定多重基于适体的测定的有用检测范围是困难的。

技术实现思路

1、在一个实施方案中，本公开提供了一种适体检测的方法，所述方法包括在允许分析物-适体复合物形成的条件下使样品的分析物与多种适体接触，其中所述多种适体中的不同适体对所述分析物中的相应不同分析物具有特异性亲和力。所述方法还包括通过检测所述分析物-适体复合物中的适体来检测所述分析物。检测所述多种适体中的单独适体包括使所述单独适体与第一探针的混合物接触，其中所述混合物中的每个第一探针的第一互补区域与所述单独适体的第一区域杂交，并且其中所述混合物中仅所述第一探针的子集与亲和标签偶联。所述检测还包括使所述单独适体与第二探针接触以使所述第二探针的第二互补区域与所述单独适体的第二区域杂交，并且其中所述第二探针包含从所述互补区域延伸的非杂交区域，所述非杂交区域包含唯一地鉴定所述单独适体的鉴定序列，其中所述第一互补区域和所述第二互补区域与所述单独适体唯一地杂交。所述检测还包括经由所述亲和标签与亲和标签结合剂的结合捕获所述混合物中的第一探针，以捕获所述单独适体和与所述单独适体的所述第二区域杂交的所述第二探针，其中所述第一探针在与所述亲和标签偶联的所述子集中。所述检测还包括检测所捕获的第二探针的所述鉴定序列。

2、在一个实施方案中，本公开提供了一种适体检测探针集。所述适体检测探针集包括与适体组的相应不同适体互补的多种不同第一探针混合物。所述多种不同第一探针混合物中的单独第一探针混合物包括与亲和标签偶联的第一探针的结合子集；以及第一探针的虚拟子集，并且其中所述单独第一探针混合物的所述结合子集和所述虚拟子集中的每种探针包含与所述适体组的单独适体的第一序列互补的相同结合区域。所述适体检测探针集还包括与所述适体组的所述相应不同适体互补的多种不同第二探针，其中所述多种不同第二探针中的单独第二探针包含与所述单独适体的第二序列互补的第二结合区域，并且其中所述单独第二探针包含非杂交区域，所述非杂交区域包含唯一地鉴定所述单独适体的鉴定序列。在某些实施方案中，适体检测探针集可以用于生成适用于下一代测序技术的寡核苷酸。因此，使用适体检测探针集的适体检测可以包括使用下一代测序(ngs)技术对所生成的寡核苷酸中的鉴定序列进行测序。此外，所生成的寡核苷酸可以包括一个或多个适体序列和/或样品特异性索引序列，以允许在单次测序运行中进行多重化。

3、在一个实施方案中，本公开提供了一种适体检测探针集。所述适体检测探针集包括与适体组的相应不同适体互补的多种不同第一探针混合物。所述多种不同第一探针混合物中的每种第一探针混合物包括第一探针的结合子集；以及不与亲和标签偶联的第一探针的虚拟子集，并且其中每种第一探针混合物包含与所述适体组的适体互补的结合区域，并且其中所述结合区域对于每种第一探针混合物是独特的，使得每种第一探针混合物与所述适体组的不同适体结合，其中每种第一探针混合物相对于所述多种第一探针混合物中的其他第一探针混合物具有不同的所述结合子集与所述虚拟子集的比率。所述适体检测探针集还包括与所述适体组的所述相应不同适体互补的多种不同第二探针。

4、在一个实施方案中，本公开提供了一种适体检测探针集。所述适体检测探针集包括与适体组的相应不同适体互补的多种不同报告探针混合物。所述多种不同报告探针混合物中的单独报告探针混合物包括包含可扩增非杂交区域的报告探针的第一子集，所述非杂交区域包含唯一地鉴定所述单独适体的鉴定序列，所述鉴定序列的两侧是第一引物区域和第二引物区域并且能够使用与所述第一引物区域和所述第二引物区域互补或对应(例如，与所述第一引物区域和所述第二引物区域具有相同序列)的引物来扩增；以及报告探针的第二子集，并且其中所述单独报告探针混合物的所述第一子集和所述第二子集中的每种探针包含与所述适体组的单独适体的第一序列互补的相同结合区域，其中所述单独第二探针包含不能使用所述引物来扩增的不可扩增非杂交区域。所述适体检测探针集还包括与所述适体组的所述相应不同适体互补的多种不同捕获探针，其中所述多种不同捕获探针中的单独捕获探针包含与所述单独适体的第二序列互补的第二结合区域，并且其中所述多种捕获探针中的每种捕获探针与亲和标签偶联。

5、在一个实施方案中，本公开提供了一种适体检测的方法，所述方法包括使单独适体与报告探针接触，所述报告探针与所述单独适体的第一区域杂交，其中所述报告探针的第一子集包含可扩增非杂交区域，所述可扩增非杂交区域包含唯一地鉴定所述单独适体的鉴定序列，所述鉴定序列的两侧是第一引物区域和第二引物区域，并且第二子集包含不可扩增非杂交区域；使所述单独适体与捕获探针接触，其中所述捕获探针与所述单独适体的第二区域杂交，并且其中所述捕获探针与亲和标签缔合；经由所述亲和标签与亲和标签结合剂的结合捕获所述捕获探针，以捕获所述单独适体和包含与所述单独适体的所述第一区域杂交的所述可扩增非杂交区域的所述报告探针；以及经由所述鉴定序列的扩增来检测所捕获的报告探针的所述鉴定序列。

6、在一个实施方案中，本公开提供了一种适体检测的方法，所述方法包括使适体和与相应不同适体杂交的探针接触，其中每种探针的互补区域与所述适体中的单独适体杂交，并且其中每种探针包含从所述互补区域延伸的非杂交区域，所述非杂交区域包含唯一地鉴定每种单独适体的鉴定序列；使用外切核酸酶去除未与所述适体杂交的过量探针；以及在去除所述过量探针之后检测所捕获的探针中的所述鉴定序列。

7、在一个实施方案中，本公开提供了一种适体检测的方法，所述方法包括使第一适体和第二适体与报告探针接触，所述报告探针包含与所述第一适体杂交的第一子集和与所述第二适体杂交的第二子集，其中所述第一子集的所述报告探针包含第一非杂交区域，所述第一非杂交区域包含唯一地鉴定所述第一适体的第一鉴定序列和第一组捕获序列，并且其中所述第二子集的所述报告探针包含第二非杂交区域，所述第二非杂交区域包含唯一地鉴定所述第二适体的第二鉴定序列和所述第一组捕获序列。所述方法还包括使所述第一适体和所述第二适体与捕获探针接触，其中所述捕获探针与所述第一适体或所述第二适体杂交，并且其中所述捕获探针与亲和标签缔合；经由所述亲和标签与亲和标签结合剂的结合捕获所述捕获探针，以捕获所述第一适体和第二适体以及所述报告探针；生成包含来自所述第一子集的所述第一鉴定序列和所述第一组捕获序列的第一寡核苷酸，并生成包含来自所述第二子集的所述第二鉴定序列和所述第一组捕获序列的第二寡核苷酸；使用携带与所述第一组捕获序列互补的序列的第一组珠粒捕获所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸；以及检测所捕获的第一寡核苷酸中的所述第一鉴定序列和所述第二寡核苷酸中的所述第二鉴定序列，以检测所述第一适体和所述第二适体。

8、在一个实施方案中，本公开提供了一种适体检测的方法，所述方法包括使单独适体和与所述单独适体的第一区域杂交的第一报告探针以及与所述单独适体的第二区域杂交的第二报告探针接触，其中所述第一报告探针包含第一非杂交区域，所述非杂交区域包含唯一地鉴定所述单独适体的第一鉴定序列，其中所述第二报告探针包含第二非杂交区域，所述第二非杂交区域包含唯一地鉴定所述单独适体的第二鉴定序列；将所述第一鉴定序列和所述第二鉴定序列的末端彼此连接，以生成连接报告探针；使用与所述第一报告探针或所述第二报告探针偶联的亲和标签捕获连接报告探针；以及经由所捕获的连接报告探针的扩增来检测所述第一鉴定序列和所述第二鉴定序列，以检测所述单独适体。

9、在一个实施方案中，本公开提供了一种适体检测的方法，所述方法包括在允许分析物-适体复合物形成的条件下使样品的分析物与多种适体接触，其中所述多种适体中的不同适体对所述分析物中的相应不同分析物具有特异性亲和力；通过检测所述分析物-适体复合物中的适体来检测所述分析物，其中检测所述多种适体中的单独适体包括：使所述单独适体与第一探针的混合物接触，其中所述混合物中的每个第一探针的第一互补区域能够与所述单独适体的第一区域杂交，并且其中所述混合物中仅所述第一探针的子集与亲和标签偶联，使得所述混合物中的第一探针与所述单独适体的所述第一区域杂交；使所述单独适体与第二探针接触以使所述第二探针的第二互补区域与所述单独适体的第二区域杂交，并且其中所述第二探针包含从所述互补区域延伸的非杂交区域，所述非杂交区域包含唯一地鉴定所述单独适体的鉴定序列，其中所述第一互补区域和所述第二互补区域与所述单独适体唯一地杂交；将与所述单独适体的所述第一区域杂交的所述第一探针连接到与所述单独适体的所述第二区域杂交的所述第二探针；经由所述亲和标签与亲和标签结合剂的结合捕获所述第一探针，以捕获所述单独适体和与所述单独适体的所述第二区域杂交并且连接到所述第一探针的所述第二探针，其中所述第一探针在与所述亲和标签偶联的所述子集中；以及检测所捕获的第二探针的所述鉴定序列。

10、在一个实施方案中，本公开提供了一种适体检测的方法，所述方法包括在允许分析物-适体复合物形成的条件下使样品的分析物与多种适体接触，其中所述多种适体中的不同适体对所述分析物中的相应不同分析物具有特异性亲和力。所述方法还包括通过检测所述分析物-适体复合物中的适体来检测所述分析物。所述检测包括使所述单独适体与第一探针的混合物接触，其中所述混合物中的每个第一探针的第一互补区域与所述单独适体的第一区域杂交，并且其中所述混合物中仅所述第一探针的子集与亲和标签偶联；使所述单独适体与第二探针接触以使所述第二探针的第二互补区域与所述单独适体的第二区域杂交，并且其中所述第二探针包含从所述互补区域延伸的非杂交区域，所述非杂交区域包含唯一地鉴定所述单独适体的鉴定序列，其中所述第一互补区域和所述第二互补区域与所述单独适体唯一地杂交；经由所述亲和标签与亲和标签结合剂的结合捕获所述混合物中的第一探针，以捕获所述单独适体和与所述单独适体的所述第二区域杂交的所述第二探针，其中所述第一探针在与所述亲和标签偶联的所述子集中；使用引物对由所捕获的第二探针生成扩增产物，其中所述引物对包含与所述第二探针的不包括所述第二互补区域并且不包括所述鉴定序列的区域互补的第一引物；以及对所述扩增产物进行测序。

11、在一个实施方案中，本公开提供了一种测序的方法，所述方法包括由序列文库生成序列数据。所述序列文库通过以下过程制备：在允许分析物-适体复合物形成的条件下使样品的分析物与多种适体接触，其中所述多种适体中的不同适体对所述分析物中的相应不同分析物具有特异性亲和力；通过使报告探针和虚拟探针与所述多种适体中的单独适体杂交来形成第一类型的第一多种适体复合物，其中所述虚拟探针包含与所述单独适体的第一区域杂交的第一互补区域，并且其中所述报告探针包含与所述单独适体的第二区域杂交的第二互补区域和从所述互补区域延伸的非杂交区域，所述非杂交区域包含唯一地鉴定所述单独适体的鉴定序列；通过使所述报告探针和捕获探针与所述单独适体杂交来形成第二类型的第二多种适体复合物，其中所述捕获探针包含与所述单独适体的第一区域杂交的所述第一互补区域以及亲和标签；经由所述亲和标签将所述第二多种适体复合物与所述第一多种适体复合物分离，以生成分离的第二多种适体复合物；以及扩增所分离的第二多种适体复合物的所述报告探针的一部分，以生成所述序列文库。所述方法还包括鉴定所述序列数据中的所述鉴定序列；以及基于所述鉴定生成所述单独适体存在于所述样品中的通知。在实施方案中，所述方法还包括对在所述序列数据中鉴定的鉴定序列进行定量，以测量所述样品中存在的适体的相对量。所鉴定的鉴定序列的数量允许对适体的相对量进行定量。