黄杆菌S3及其应用

黄杆菌s3及其应用
技术领域
1.本发明属于生物工程和环境修复技术领域，具体涉及了黄杆菌s3及其应用。


背景技术：

2.多环芳烃是煤、石油、木材、烟草等不完全燃烧时产生的挥发性碳氢化合物，随着工业的迅猛发展，环境中的多环芳烃浓度不断增加，对环境及食品安全存在重大的威胁。陆地、空气中的多环芳烃通过地表径流、大气沉降等各种方式进入河流及湖泊，最终沉积在底泥中，而湖泊、河流底泥作为多环芳烃最大的储库却缺少关注，大部分研究仍集中在地表。
3.多环芳烃的处理方式多样，包括加热、絮凝沉淀、吸附等物理方式，光氧化、试剂氧化等化学方式，从经济成本、环境友好方面考虑，微生物降解仍是一种很有前途的pahs去除方式。目前已发现100多个属的细菌具有降解pahs的能力，包括。但大部分微生物取样生境限于农田、工厂周边及污水处理厂等较为特殊且多环芳烃浓度较高的场所，筛选而来的大部分细菌对多环芳烃的高效降解作用仅限于实验室中，实际环境中的作用不尽人意。而湖泊、河流等水生环境同人类生活密切相关，嫌少研究关注到淡水水生环境沉积物中的多环芳烃降解及生物修复。
4.已有研究表明南方湖泊中常见的苦草对多环芳烃具有良好的降解作用，根系群落与苦草愈相近的沉水植物对多环芳烃的降解作用俞强。针对湖泊底泥中日益增加的多环芳烃浓度，寻找适应普通湖泊底泥环境，并对多环芳烃具有降解作用的微生物，成为生物修复沉积物重要的一环。


技术实现要素：

5.发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了适应沉水植物苦草根际环境的可降解多环芳烃的菌株黄杆菌(xanthobacteraceae bacterium)s3及其应用。
6.技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了黄杆菌(xanthobacteraceae bacterium)s3，所述黄杆菌(xanthobacteraceae bacterium)s3已于2022年5月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc no：m 2022743，保藏地址为：中国武汉武汉大学，邮编：430072，本发明的黄杆菌是从苦草根际底泥中筛选而来，其适应底泥环境的同时，可降解多环芳烃的功能性降解菌。
7.本发明内容还包括黄杆菌(xanthobacteraceae bacterium)s3的培养方法，将黄杆菌(xanthobacteraceae bacterium)s3通过lb培养基培养避光振荡培养，ph为5～9，培养温度为25～40℃，盐度为0.1-5％。
8.其中，所述ph为7，温度为37℃，盐度为0.1-1％。
9.其中，所述培养基中还包括芘溶液。
10.本发明内容还包括所述的黄杆菌(xanthobacteraceae bacterium)s3在降解多环芳烃中的应用。
11.其中，所述多环芳烃为芘。
12.其中，所述芘浓度为1-200mg/l。
13.所述应用的条件为：培养温度为25～40℃，ph为5～7，盐度为0～1.5％。
14.本发明内容还包括一种降解污染物芘的方法，包括以下步骤：
15.1)将黄杆菌(xanthobacteraceae bacterium)s3通过lb培养基培养至浑浊后，于无菌离心管中，离心后用基础盐培养基清洗，用基础盐培养基稀释混匀制备的菌液；
16.2)取芘溶液于灭菌的试管中，待丙酮挥发后，加入基础盐培养基，调节ph5～7与nacl％为0～1.5％，高温灭菌后，加入步骤1)制备的菌液中，在25～40℃暗处培养1～28天。
17.其中，所述基础盐培养基包括磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，硫酸铵，氯化镁，四水钙盐和微量元素。
18.其中，所述方法通过建立回归模型确定黄杆菌(xanthobacteraceae bacterium)s3的最佳芘降解条件，所述回归模型为：
19.y(％)＝85.59-5.47a-6.47b-21.80c-4.60ab-4.85ac+7.52bc+0.2662a
2-5.19b
2-32.09c2。
20.有益效果：与现有菌株相比，本次筛选出来的菌株的优点是：黄杆菌(xanthobacteraceae bacterium)s3从水下苦草根系筛选而来，适应水下沉积环境的同时，可高效降解多环芳烃，在ph7.0，盐度为0，温度28.5℃的条件下，一周内可将1mg/l的芘降解90.26％，在沉积物多环芳烃污染修复中有较好的应用前景。
附图说明
21.图1为s3菌株在不同盐度(a)、ph(b)和温度(c)条件下的生长曲线；
22.图2为反应各因素交互作用对s3菌株降解率影响的响应面曲线。
具体实施方式
23.下面通过具体的实施例对本研究进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离实验原理的前提下，还可以做出若干变型和改进。
24.实施例1黄杆菌s3的筛选过程
25.1、培养基：
26.a.lb培养基(g/l)：酵母提取物5，胰蛋白胨10，nacl 10，琼脂15，ph＝7.0
27.b.基础盐培养基(g/l)：磷酸氢二钠2.8，磷酸二氢钾1.0，硫酸铵0.5，氯化镁0.053，四水钙盐0.05，微量元素1ml
28.c微量元素(g/l)：edta0.5，硫酸亚铁0.2，七水硫酸锌0.01，四水氯化锰0.003，硼酸0.03，六水氯化钴0.02，二水氯化铜0.001，六水氯化镍0.002，二水硼酸钠0.003
29.d.筛选培养基(g/l)：在基础盐培养基中加入20g
·
l-1
的琼脂粉制成平板，后均匀涂抹8mg/ml芘溶液(溶于丙酮)
30.所有培养基均用去离子水配制，0.1mpa，121℃灭菌15分钟，冷却后备用。
31.2、初筛方法如下：取采集到的苦草根际底泥10g，放入含400mg/l芘的基础盐培养基100ml，在摇床上进行培养20d；静置20min后，取1ml上清液，于9ml灭菌水中，混匀制成底泥菌悬液，后依次取1ml稀释液加入不同体积的无菌水中，分别制成0.01，0.001，0.0001，0.00001，0.000001不同稀释度的底泥溶液，各取100μl进行涂布或平板划线，30℃暗处培育
2-3周。该方法获得具有在高浓度芘存活的菌株10株，其中能在筛选培养基中形成明显菌斑的菌株有6株。
32.为了进一步检查菌株降解多环芳烃芘的能力，将初筛中选取的6株可降解多环芳烃的菌株，接入含有唯一碳源芘的基础盐培养基中(5mg/l芘)，每个菌种6瓶(10ml瓶)，35℃，180rpm，培养14天，间隔7天，每个菌种取3瓶，测定培养基中芘残余浓度，最后筛选得到1株降解芘能力较强的黄杆菌s3，所述的黄杆菌(xanthobacteraceae bacterium)s3已于2022年5月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc no：m 2022743。
33.3、芘残余浓度检测方法：实验采用破坏性采集方式，于培养基中加入等体积的二氯甲烷，涡旋5min，静置20min，取下层有机相，过无水硫酸钠干燥后，由gc-ms测定芘浓度，gc-ms分析参数为：db-5ms(30nm
×
0.25mm
×
0.25um)，分流比：20∶1，进样体积：1.0μl，进样口温度：280℃，柱流量：10ml min-1，升温程序：90℃2min，20℃min-1)升温至180℃，维持5min，10℃min-1升温至300℃保持5min，ei离子源，电离能70ev，离子源温度：230℃，四极杆温度：150℃，溶剂延迟：5.5min，质量数扫描范围：45～450u，sim模式。
34.实施例2：菌株s3的生物学性质鉴定
35.菌株s3的生物学性质：在固体培养基平板上96h生长菌落呈圆形，直径约1mm，表面光滑、淡黄色、不透明，边缘平整，中间有突起；在斜面划线培养，菌落延划线生长，边缘平整；在摇瓶中培养，培养液呈黄色，不透明。
36.s3菌株的ncbi比对鉴定结果是：黄杆菌(xanthobacteraceae bacterium)s3，proability(可能性)：100％。即16s rdna序列(seq id no：1所示)的pcr产物为1332bp，该16s rdna序列在genbank中登录号为on527741。测序结果通过ncbi blast数据库与已知序列(同源性》99％)比较，结果显示s3菌株与xanthobacteraceae(黄杆菌)同源性可达100％。综合两项鉴定结果，该菌可以被鉴定到种，命名为黄杆菌(xanthobacteraceae bacterium)s3。
37.实施例3：s3菌株的生长特性
38.本实验以菌液在od
600
处的吸光度为考核标准，考察s3菌株最适生长温度、ph及盐度。黄杆菌l1i3菌株通过lb培养基培养至浑浊后，于无菌离心管中，4℃，10000rpm，离心5min，后用基础盐培养基清洗离心3次，用基础盐培养基稀释混匀制备成od
600
值为1.000的菌悬液。将菌悬液以10％的体积比分别接种于含有1％nacl的lb培养基中，同时设定对照组，每组均设置5个平行。设置lb培养基初始ph分别为5，6，7，8，9，于175rpm
·
min-1
，35℃摇床中避光振荡培养，连续测取样测定菌液的od
600
值变化，以探究s3的最适生长ph。按照上诉步骤，将菌悬液接种于ph为7的lb培养基中，lb培养基中nacl含量分别设置为0.1％，0.5％，1％，2％，5％，以探究最佳生长盐度。将菌悬液接种于ph为7、nacl含量为1％的lb培养基中，分别设置摇床温度为25、30、35、40℃，以探究s3菌株最适生长温度。
39.测定不同温度、ph和盐度下菌液的od值，绘制不同条件下s3菌株的生长曲线。图1为s3菌株在不同盐度(a)、ph(b)和温度(c)条件下的生长曲线。由图1结果可知s3菌株最佳生长条件为ph7，温度37℃，盐度范围0.1-1％。
40.实施例4：本实验说明s3菌株芘降解特性
41.本实验主要考察降解温度、培养基ph和培养基盐度三个因子对s3菌株降解芘效率
的影响。温度范围设置为25-40℃，ph5-7，盐度用nacl百分含量表示，naci％范围设置0-1.5。通过design expert 12软件进行box-behnken实验设计，具体实验如表1所示。
42.s3菌株通过lb培养基培养至浑浊后，于无菌离心管中，4℃，10000rpm，离心5min，后用基础盐培养基清洗离心3次，用基础盐培养基稀释混匀制备成od
600
值为1.000的菌液。
43.取100μl 100mg/l芘溶液(丙酮配制)于灭菌的试管中，待丙酮挥发后，加入9ml基础盐培养基(ph与nacl％调节至表1所设目标值于121℃高温灭菌15min)，加入由前准备好的s3实验菌液。于各设置的温度中暗处培养4天，具体温度见表1。每组实验三次平行。
44.通过实验结果建立回归模型：
45.y(％)＝85.59-5.47a-6.47b-21.80c-4.60ab-4.85ac+7.52bc+0.2662a
2-5.19b
2-32.09c246.由回归模型方差分析结果可知，该模型p值小于0.0001，回归方程极为显著，失拟项p为0.3566，不显著，说明模型拟合程度较好，r2为0.993，相关性较好，表示该模型充分优化了降解参数。根据表2中f值的大小可判断各影响因素的强弱，依次为c＞b＞a。
47.根据回归方程绘制的响应面图见图2，图中可直观看出影响因素与响应面的关系，即曲线越陡峭，该因素对芘降解效率影响越大。图2反应各因素交互作用对s3菌株降解率影响，可以看出因素c(温度)对响应值影响最大，表现为曲线陡峭，因素b(nacl％)和因素a(ph)次之，因素a曲线最为平滑，与方差分析结果一致。通过此回归模型获得黄杆菌s3最优降解条件为ph7，nacl％为0，温度28.50。预测此实验条件下s3菌株对芘的理论降解率可达95.37％。为验证模型预测的准确性，采用上述最佳降解条件，3次平行实验得到芘实际降解率为90.26％，较为接近，说明该模型很好的优化s3降解芘条件。
48.表1 box-behnken实验设计及降解率结果
49.[0050][0051]
表2
[0052]
[0053][0054]
实施例5：s3菌株可降解不同芘浓度的应用
[0055]
本实验以s3菌株芘降解率为考核标准，考察s3菌株对不同浓度芘的降解效率。实验降解条件设置为ph7，nacl％0，温度28.50，芘浓度梯度设置为1、5、100、200mg/l，检测间隔时间为7天，具体实验操作同实施例4。实验结果如表3。
[0056]
表3
[0057][0058]
由结果可知，当芘浓度为1mg/l时，培养至第7天时，芘降解率可达98.29％，芘浓度为5mg/l时，培养时间至14天时，降解率可达91.42％，增加培养体系中芘浓度至100mg/l，培养至21天以后，降解率达92.04％，芘浓度增加至200mg/l时，28天后，芘降解率达99.54％。
[0059]
结果表明，s3菌株在低浓度1mg/l和高浓度200mg/l，均可有效降解体系中的芘。