基于PCR-RFLP快速鉴定NX型禾谷镰刀菌的引物及方法

本发明属于镰刀菌产毒基因型鉴定，具体涉及一种基于pcr-rflp快速鉴定nx型禾谷镰刀菌的引物及方法。

背景技术：

1、小麦赤霉病是一种严重的植物病害，被称为小麦的“癌症”，在世界范围内广泛流行。禾谷镰刀菌是引起世界范围内小麦赤霉病的主要病原菌，危害极其严重。

2、除了造成严重的产量损失，禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)可以产生多种真菌毒素，威胁人畜健康。其中，以单端孢霉烯毒素危害最为普遍，已成为影响粮食生产和食品安全的重大隐患。之前的研究认为，禾谷镰刀菌只能产生b类单端孢霉烯毒素，包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)和雪腐镰刀菌烯醇(niv)，以及don的乙酰化产物3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3a-don)和15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15a-don)。3a-don型、15a-don型和niv型禾谷镰刀菌被统称为b型禾谷镰刀菌。

3、然而，近年来发现了一种可以产a类单端孢霉烯毒素的禾谷镰刀菌菌株，该类禾谷镰刀菌被称为nx型菌株，其产生的a类单端孢霉烯毒素被命名为nx毒素(varga,e.；wiesenberger,g.；hametner,c.；ward,t.j.；dong,y.；d.；mccormick,s.；broz,k.；stückler,r.；schuhmacher,r.；krska,r.；kistler,h.c.；berthiller,f.；adam,g.newtricks of an old enemy:isolates of fusarium graminearum produce a type atrichothecene mycotoxin.environ.microbiol.2015,17(8),2588–2600.)。nx型禾谷镰刀菌群体的出现给小麦生产、食品安全带来了新的严峻挑战。深入系统开展nx型禾谷镰刀菌鉴定技术、种群分布特征、产毒机理研究是当前面临的新的科学问题。然而，由于目前尚无商品化的nx毒素标准品可以获得，给谷物nx毒素污染风险评估、nx型菌株群体分布研究带来了困难。因此亟待开发相关的分子鉴定方法，为农业生产、检验检疫等提供便利。

4、明确危害小麦禾谷镰刀菌的产毒类型对开展病害流行、防控及真菌毒素污染风险评估具有重要意义。传统方法是对禾谷镰刀菌进行培养后提取毒素，然后进行色质谱分析，通过化学检测明确菌株的产毒类型。然而，传统方法具有周期长、需要使用毒素标准品(目前尚无商品化的nx毒素标准品可以获得)、需要配置价格昂贵的大型色质谱仪器设备等缺点。因此，基于dna序列多态性，开发禾谷镰刀菌产毒基因型快速鉴定方法，对进行小麦等谷物中真菌毒素污染风险评估及有针对性地开展病害及毒素污染防控工作具有重要意义。

5、因此，非常有必要建立准确鉴定nx型禾谷镰刀菌的技术体系，为农业生产、病害防治和科学研究提供技术支持。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术中的不足，发明人开展了大量的前期研究工作，成功开发了两组基于pcr-rflp快速鉴定nx型禾谷镰刀菌的方法，实现了技术突破。相较于传统的化学分析技术，该分子鉴定方法具有成本低、安全性高、通量高、速度快、不需要购置昂贵的色质谱仪器等诸多优点。

2、为达到上述目的，本发明的解决方案是：

3、一种基于pcr-rflp快速鉴定nx型禾谷镰刀菌的引物，引物包括：

4、nx-tri1f：5′-aacactacctcggtgctaaca-3′(seq id no.1)，

5、nx-tri1r1：5′-actctcctgatctcttcctgc-3′(seq id no.2)，

6、nx-tri1r2：5′-cactcgtagttgagcaaaagg-3′(seq id no.3)。

7、一种基于pcr-rflp快速鉴定nx型禾谷镰刀菌的方法，其包括如下步骤：

8、(1)、以nx型禾谷镰刀菌基因组dna为模板扩增tri1基因的部分序列得到扩增基因片段，所用引物为上述的引物；

9、(2)、使用琼脂糖凝胶回收试剂盒或pcr产物回收试剂盒对步骤(1)所得扩增产物进行回收纯化；

10、(3)、对步骤(2)所得纯化产物进行酶切；

11、(4)、将步骤(3)所得酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，并对结果进行分析和判定。

12、优选地，步骤(1)中，禾谷镰刀菌基因组dna的浓度为50-200ng/μl，进一步优选为100ng/μl；引物工作浓度为10ng/μl。

13、优选地，步骤(1)中，引物组合方式共2种，具体选自nx-tri1f与nx-tri1r1组合、或者nx-tri1f与nx-tri1r2组合，两种组合方式选择其中一种即可。引物nx-tri1f、nx-tri1r1、nx-tri1r2为page纯化，工作浓度为10μm。

14、优选地，若引物为nx-tri1f与nx-tri1r1组合，扩增基因片段长度约为550bp，pcr反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性40s，60℃复性20s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min。

15、若引物为nx-tri1f与nx-tri1r2组合，扩增基因片段长度约为1010bp，pcr反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性40s，60℃复性20s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸5min。

16、优选地，步骤(3)中，酶切时，使用限制性内切酶bcli或nhei进行酶切，酶切体系中各成分的量或工作浓度为：步骤(2)所得纯化产物1μg、限制性内切酶2u、1×限制性内切酶buffer、无菌水补齐体系至20μl，限制性内切酶最优反应温度37℃下进行酶切反应，反应时间为1-1.5h(优选为1.5h)，酶切完成后，将酶切产物迅速置于冰上冷却。

17、优选地，步骤(4)中，琼脂糖凝胶电泳中琼脂糖的浓度为1-2％。

18、优选地，步骤(4)中，结果的判定方法为：有着明显两个条带的禾谷镰刀菌为nx型禾谷镰刀菌，而只有一个条带的菌株为常规b型禾谷镰刀菌。

19、由于采用上述方案，本发明的有益效果是：

20、1.相较于传统的化学分析技术，本发明的分子鉴定方法具有引物重复性好、特异性高、无假阳性、成本低、操作简单、安全性高、通量高、速度快、不需要购置昂贵的色质谱仪器等诸多优点，能够用于快速鉴定nx型的禾谷镰刀菌菌株，为基础农业技术人员、科研人员及检验检疫单位开展nx型禾谷镰刀菌鉴定、预测预报和防治、海关检疫提供了一种新的便利方法。

21、2.使用本发明可快速、准确地对nx型禾谷镰刀菌菌株进行鉴定，因而对其针对性地实施预测预报和防治、开展生物多样性研究及植物检验检疫等具有重要意义。

技术特征：

1.一种基于pcr-rflp快速鉴定nx型禾谷镰刀菌的引物，其特征在于：所述引物包括：

2.一种基于pcr-rflp快速鉴定nx型禾谷镰刀菌的方法，其特征在于：其包括如下步骤：

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述禾谷镰刀菌基因组dna的浓度为50-200 ng/μl；所述引物工作浓度为10 ng/μl。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述引物选自nx-tri1f与nx-tri1r1组合、或者nx-tri1f与nx-tri1r2组合。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：若引物为nx-tri1f与nx-tri1r1组合，扩增基因片段长度为550 bp，pcr反应条件为：94℃预变性3 min；94 ℃变性40 s，60 ℃复性20s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸5 min；

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述酶切时，使用限制性内切酶bcli或nhei进行酶切，酶切体系中各成分的量或工作浓度为：步骤（2）所得纯化产物1 μg、限制性内切酶2 u、1×限制性内切酶buffer、无菌水补齐体系至20 μl，限制性内切酶最优反应温度37 ℃下进行酶切反应，反应时间为1-1.5 h，酶切完成后，将酶切产物迅速置于冰上冷却。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（4）中，所述琼脂糖凝胶电泳中琼脂糖的浓度为1-2%。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（4）中，所述结果的判定方法为：有两个条带的禾谷镰刀菌为nx型禾谷镰刀菌，而只有一个条带的菌株为常规b型禾谷镰刀菌。

技术总结
本发明提供了一种基于PCR‑RFLP快速鉴定NX型禾谷镰刀菌的引物及方法，本发明通过分析禾谷镰刀菌及其近缘种在Tri1基因序列上的差异，获得了NX型禾谷镰刀菌特异性的SNP位点，设计了相应的限制性内切酶；即以禾谷镰刀菌基因组DNA为模板，分别利用设计开发的两组引物组合，扩增其Tri1基因部分序列；将PCR产物进行纯化后使用限制性内切酶NheI或BclI进行酶切；对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳结果观察；本发明操作简便、重复性好，特异性高，通过条带数量准确鉴定出NX型的禾谷镰刀菌菌株，为基础农业技术人员、科研人员及检验检疫单位开展NX型禾谷镰刀菌鉴定、预测预报和防治、海关检疫提供了一种新的便利方法。

技术研发人员：王建华,杨宪立,王昇,杨俊花,赵志勇,王郝玉,张梦圆
受保护的技术使用者：上海市农业科学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11