cdh1基因在鉴别花鲈来源中的应用及其RNA探针和应用

cdh1基因在鉴别花鲈来源中的应用及其rna探针和应用
技术领域
1.本发明属于生物检测技术领域，特别涉及一种cdh1基因在鉴别花鲈来源中的应用及其rna探针和应用。


背景技术：

2.花鲈（lateolabrax maculatus），隶属鲈形目（perciformes）、鮨科（serranidae）、花鲈属（lateolabrax），俗称海鲈、七星鲈、寨花等。花鲈可以适应0~45
ꢀ‰
的盐度范围，为典型的广盐性物种，因此海水网箱、海水池塘、内陆及河口池塘等均适合花鲈规模化养殖。然而不同盐度环境下花鲈的品质有所差异，研究表明，海水养殖花鲈肌肉中多不饱和脂肪酸如epa、dha的含量显著高于淡水养殖花鲈，而决定食物甜味的关键物质甜菜碱，在海水养殖花鲈中的含量为1.81mg/g，比淡水养殖花鲈高出50%左右。在鱼肉加热后的挥发性物质中，己醛、对二甲苯等物质在淡水花鲈中含量更高，这导致淡水花鲈的腥味更浓。因此海水养殖花鲈无论是营养价值、甜味和鲜味都高于淡水养殖花鲈，因而在市场上二者的售价有明显差别，海水花鲈的市场价值更高。一些不法商贩滥竽充数，将淡水养殖的花鲈当做高品质的海水花鲈进行售卖，侵害了消费者的权益。然而仅从外观上难以区分两类花鲈，并且现有的基于肌肉品质指标的鉴定技术存在准确率低、易对鱼肉造成损伤的缺陷，因此急需开发一种精准的、肌肉无损的测定方法。


技术实现要素：

3.本发明要解决的技术问题提供一种cdh1基因在鉴别花鲈来源中的应用及其rna探针和应用。
4.鳃是鱼类渗透压调节的主要器官，鳃上皮作为维持离子平衡的核心渗透调节位点,通过形态重塑响应环境中的盐度变化。鳃重塑涉及上皮细胞的增殖和分化、分布及离子转运特征的改变等一系列分子机制。e-cadherin（cdh1）是一种定位于上皮细胞基底膜外侧的钙黏蛋白，通过调控ca
2+
依赖性的细胞黏附，参与形成细胞间粘附连接、维持细胞极性和组织完整性，然而，该基因在鱼类鳃上皮中的功能未见有研究报道。
5.本发明人的前期研究结果表明，在花鲈的盐度驯化过程中，鳃形态重塑的过程伴随着cdh1介导的鳃上皮细胞极性改变，因此本发明以cdh1作为鉴定海、淡水花鲈的分子标记物，通过cdh1基因原位杂交技术，根据其mrna阳性信号分布特征区分海、淡水花鲈，同时可以通过cdh1蛋白免疫组化技术，从蛋白水平上鉴定两类花鲈，进一步可以利用实时荧光定量pcr技术，从cdh1基因表达量的角度区分海、淡水花鲈。结果表明，在mrna及蛋白水平，cdh1 /cdh1在海水花鲈的鳃组织中仅分布于鳃小片底部及相邻鳃小片之间的鳃丝上皮，而在淡水花鲈鳃组织的鳃小片上皮（顶部、中部、底部）及相邻鳃小片之间的鳃丝上皮均检测到cdh1 /cdh1分布。此外，淡水中cdh1的mrna表达量显著高于海水。因此利用cdh1作为分子标记物在mrna和蛋白水平上均可精准区分海水与淡水花鲈，因此可以进一步应用于鉴定市售活体花鲈是否为真正的野生海捕或海水养殖花鲈。
6.本发明是通过如下技术方案来实现的：本发明提供cdh1基因在鉴别花鲈来源中的应用，所述的来源是海水来源和淡水来源。
7.本发明还提供一种提供花鲈cdh1基因rna探针，探针序列如seq id no.7和seq id no.8。
8.进一步，构建所述探针的引物为f: atgatggacaccagggc，r: ccagcggttgtgtgaga。
9.本发明还提供所述花鲈cdh1基因rna探针在鉴别花鲈海水或淡水来源中的应用，所述应用方法为利用所述花鲈cdh1基因rna探针进行花鲈鳃组织原位杂交，根据mrna阳性信号分布特征区分海、淡水花鲈，cdh1在海水花鲈的鳃组织中仅分布于鳃小片底部及相邻鳃小片之间的鳃丝上皮，而在淡水花鲈鳃组织中分布于鳃小片上皮的顶部、中部、底部及相邻鳃小片之间的鳃丝上皮。
10.本发明还提供利用所述cdh1基因表达cdh1蛋白的分布特征来鉴别花鲈来源的方法，所述来源为海水或淡水，所述方法为利用免疫组化确定cdh1蛋白的分布特征，cdh1蛋白在海水花鲈的鳃组织中仅分布于鳃小片底部及相邻鳃小片之间的鳃丝上皮，而在淡水花鲈鳃组织中分布于鳃小片上皮的顶部、中部、底部及相邻鳃小片之间的鳃丝上皮。
11.本发明还提供利用实时荧光定量pcr技术检测花鲈鳃cdh1基因相对表达量来区分花鲈来源于海水或淡水的方法，所述方法为以花鲈的18s作为内参基因，通过实时荧光定量pcr技术检测花鲈cdh1基因在海淡水中的相对表达水平，来源于淡水的花鲈cdh1的mrna表达量显著高于海水花鲈。
12.本发明与现有技术相比的有益效果：本发明首先通过原位杂交技术检测花鲈鳃cdh1基因，根据其mrna阳性信号分布特征区分海淡水花鲈，还可以通过cdh1蛋白免疫组化技术，从蛋白水平上鉴定两类花鲈，最后还可以通过cdh1基因实时荧光定量pcr技术，从定量的角度区分海淡水花鲈。本发明可以在不损伤可食用肌肉的情况下，有效应用于鉴别市售活体花鲈是否为真正的野生海捕或海水养殖花鲈，还可以为探究鳃上皮细胞在适应不同盐度环境中的增殖及分化的分子机制提供理论和技术支持。此外该发明也可以应用于其它鱼类的海淡水来源鉴定，具有广阔的应用前景。
附图说明
13.图1为花鲈cdh1基因原位杂交结果图，a：淡水花鲈鳃cdh1定位结果；b：海水花鲈鳃cdh1定位结果。
14.图2为花鲈cdh1蛋白免疫组化结果图，a：淡水花鲈鳃cdh1蛋白定位结果；b：海水花鲈鳃cdh1蛋白定位结果。
15.图3为花鲈cdh1基因在海淡水中qpcr结果图。a:淡水花鲈鳃cdh1基因表达量；b:海水花鲈鳃cdh1基因表达量。
具体实施方式
16.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下将结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制，除非另有特
别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得。
17.自山东省东营市利津县双瀛水产苗种有限责任公司购得海淡水养殖的花鲈各3尾，平均体重834
±
10.08g。用ms-222（200mg/l）麻醉处理后，收集鳃组织样品，一部分放入1.5ml的无酶ep管并放入液氮中速冻并转移至-80℃超低温冰箱保存，用于rna的提取；另一部分鳃组织放入4%pfa（多聚甲醛，depc水配置）中固定24h后换成70%酒精（depc水配置），于-20 ℃保存，用于石蜡切片的制备。
18.所有实验设计和实验对象处理均遵循中国海洋大学研究与伦理委员会的指导和批准（20141201）。
19.实施例1通过原位杂交技术定位鳃cdh1基因1、花鲈鳃组织总rna提取：（1）组织裂解：取20mg花鲈鳃组织放入1.5ml的无酶ep管中，加入1ml trizol（invitrogen， usa）和3个小钢珠，放入组织研磨机中充分研磨裂解。
20.（2）分相：向充分研磨的组织中加入200μl氯仿，振荡混匀后静置10min，自然分层。
21.（3）离心：12000rpm，4℃，离心15min，吸取450μl上清加入新的离心管中，并加入等体积的异丙醇充分振荡混匀，于-20℃静置1h，使rna析出。
22.（4）沉淀rna：将离心管置于离心机中12000rpm，4℃离心10min，弃上清，管底可见白色rna沉淀。
23.（5）乙醇离心清洗：加入1ml 75%无水乙醇，轻轻旋起沉淀，然后置于离心机中12000rpm离心10min，弃上清。换成100%无水乙醇重复此步骤。
24.（6）将rna沉淀晾干后加入20μl depc水溶解沉淀。
25.（7）rna浓度检测：rna原液1μl，使用核酸测定仪（biodropsis bd-1000，北京ostc）检测rna浓度，浓度在100ng/μl以上合格。
26.（8）rna完整性检测：制做1
‰
的琼脂糖凝胶；100ng rna，1μl 6x buffer，体系用rnase-free水补全至6μl，5μl mark验证琼脂糖凝胶可用；150v电压电泳15min。完整的rna三条带清晰可见。
27.（9）提取的rna可置于-80℃长期保存2、反转录cdna先将rna稀释至500ng/μl，根据反转录试剂盒（hiscript
®ꢀⅲꢀ
rt supermix for qpcr（+gdna wiper））（vazyme，china）说明书进行操作。
28.（1）去除基因组dna，将4μl 4
×
gdna wiper mix和1
µ
l rna加入200
µ
l无酶ep管中，然后加rnase-free ddh2o至16
µ
l。震荡混匀后短暂离心，放入pcr仪，42℃反应2min。
29.（2）向ep管中加入4
µ
l 5
×
hiscript iii qrt supermix，振荡混匀，pcr仪中37℃，15min；85℃，5s。反应结束后将cdna放入-20℃备用。
30.3、原位杂交探针合成（1）设计引物：根据花鲈cdh1基因序列，利用primer5软件设计特异性探针引物，在上游引物的5’端加上保护碱基和sp6启动子（atttaggtgacactatagaagcg），在下游引物的5’端加上保护碱基和t7启动子（taatacgactcactatagggagaca），引物序列：f：atgatggacaccagggc，r：ccagcggttgtgtgaga（2）以花鲈鳃组织的cdna为模板，用2
×
phanta
®
max master mix（dye plus）高保
真酶试剂盒（vazyme，china）进行pcr反应。
31.（3）pcr反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切下后用fast pure gel dna extraction mini kit胶回收试剂盒（vazyme，china）回收，送至华大基因股份有限公司进行测序。
32.（4）利用测序成功的胶回收产物和dig rna labeling kit（sp6/t7）（roche diagnostics，germany）试剂盒进行体外转录，分别合成dig标记的正义和反义探针，探针序列如表4所示。
33.探针合成体系组成为：1.0μg 胶回收cdna模板，2.0μl 10*ntp，2.0μl 10*聚合酶buffer，1.0μl rnase inhibitor，此外，阳性探针合成需要2.0μl sp6 rna聚合酶，而阴性探针合成需要2.0μl t7 rna聚合酶，二者都需要用depc水补充至20μl体系。
34.（5）通过琼脂糖凝胶电泳检测探针的完整性，用bd1000核酸分析仪测定探针浓度，-80℃冻存备用。
35.4、组织切片（1）固定。取花鲈鳃组织样品，用pbs冲洗多余血细胞，后置于无rna酶的ep管中，放入4%pfa（多聚甲醛，depc水配置）中固定24h后换成70%酒精（depc水配置），于-20℃保存。
36.（2）石蜡包埋：将固定好的花鲈鳃组织放入电脑程控组织脱水机（ppdt-12c）中脱水，脱水程序：（70%乙醇40min，80%乙醇30min，95%乙醇30min，95%乙醇20min，100%乙醇15min
×
2），二甲苯透明（1/2乙醇＋1/2二甲苯混合液10min，二甲苯10min，二甲苯5min），浸蜡（石蜡60min
×
3），石蜡包埋后，样品于4℃保存。
37.（3）切片与展片：将包埋好的样品用leica-rm201切片机进行连续切片，切片厚度为7
µ
m，将切片于40℃水浴中展平，后置于原位杂交专用防脱载玻片上，38℃烘干使组织贴紧载玻片，防止脱落。
38.（4）脱蜡与复水：将载玻片置于二甲苯中脱蜡数分钟，梯度乙醇（100%、95%、85%、70%）复水。
39.（5）0.01m 磷酸盐缓冲液（pbs）冲洗10min（6）0.2m hcl冲洗8min以除去内源性碱性磷酸酶。
40.（7）蛋白酶k消化:将冲洗好的样品用蛋白酶k（10μg/ml）37℃消化5min，以暴露目的基因mrna位点。
41.（8）0.01m pbs冲洗10min。
42.（9）用含有三乙醇胺（0.1mol/l）和0.25%醋酸酐（ph=8）的乙酰化试剂冲洗10min以消除静电荷引起的探针非特异性吸附。
43.（10）柠檬酸钠（ssc）缓冲液冲洗10min。
44.5、预杂交与杂交（1）预杂交：将每张载玻片上滴加200
µ
l 杂交缓冲液于55℃预杂交1h。杂交缓冲液体系组成为：0.1g 硫酸葡聚糖，500μl 去离子甲酰胺，250μl 20xssc，100μl 50xdenhardt’s，100μl trna(0.5mg/ml），50μl depc水。
45.（2）杂交：预杂交结束后用杂交缓冲液稀释探针（0.2μl 探针加120~200μl稀释液）并置于pcr仪中95℃变性5min，迅速置于冰上2min，然后将稀释好的探针滴加在载玻片的组织上，55℃杂交16-20h。
46.（3）杂交结束后用梯度ssc缓冲液（5*ssc、2*ssc、1*ssc和0.2*ssc）冲洗，每个梯度20-30min。
47.（4）washingbuffer（1*mabt）冲洗两遍，每遍5min。
48.（5）封闭：用blockingbuffer封闭30min。所述blockingbuffer制备方法为：将bdignucleicaciddetectionkit试剂盒（rochediagnostics，germany）中的blockingreagent粉末1g加入到100ml1*mabt中，加热（37℃左右）溶解。冷却后加入100μl抑菌防腐剂proclean300（碧云天，china）混匀后4℃保存。所述1*mabt溶液配置方法为：用纯水将5x马来酸缓冲液（5*mab）稀释5倍并加入0.1%的吐温20，其中5x马来酸缓冲液体系组成为：58g马来酸（顺丁烯二酸），43.5gnacl，40gnaoh，纯水定容至1l，ph7.22。
49.（6）抗体孵育：用blockingbuffer按1:400稀释anti-digoxigenin-pod（poly）抗体（rochediagnostics，germany），常温孵1h。
50.（7）washingbuffer冲洗4次，每次10min。
51.（8）detectionbuffer中平衡5min。
52.（9）显色：用detectionbuffer稀释nbt/bcip显色液（rochediagnostics，germany），每张切片滴加200
µ
l显色液避光显色。
53.（10）复染：1%中性红复染数秒，梯度乙醇（75%、85%、95%、100%，每个梯度2-3min）脱水、二甲苯（两遍，每遍10min）透明，中性树胶封片，晾干后用显微镜（olympμsbx53）拍照观察。
54.（11）结果。如图1所示，根据cdh1基因的mrna阳性信号分布可知，淡水花鲈cdh1基因主要分布在鳃小片上皮（顶部、中部、底部）及相邻鳃小片之间的鳃丝上皮，而海水花鲈鳃上cdh1基因仅分布于鳃小片底部及相邻鳃小片之间的鳃丝上皮，此外，海水花鲈鳃中的cdh1阳性信号强度也明显低于淡水鳃组织。
55.实施例2通过免疫组化技术定位花鲈鳃cdh1蛋白（1）固定。取海淡水养殖花鲈鳃组织样品，用pbs冲洗多余血细胞，后置于无rna酶的ep管中，放入4%pfa（多聚甲醛，depc水配置）中固定24h后换成70%酒精（depc水配置），于-20℃保存。
56.（2）石蜡包埋：将固定好的花鲈鳃组织放入电脑程控组织脱水机（ppdt-12c）中脱水，脱水程序：（70%乙醇40min，80%乙醇30min，95%乙醇30min，95%乙醇20min，100%乙醇15min
×
2），二甲苯透明（1/2乙醇＋1/2二甲苯混合液10min，二甲苯10min，二甲苯5min），浸蜡（石蜡60min
×
3），石蜡包埋后，样品于4℃保存。
57.（3）切片与展片：将包埋好的样品用leica-rm201切片机进行连续切片，切片厚度为5
µ
m，将切片于40℃水浴中展平置于原位杂交专用防脱载玻片上，将切片放入60℃烘箱中烘烤30min左右，使石蜡融化并除去残留水分。
58.（4）脱蜡与复水：将载玻片置于二甲苯中脱蜡数分钟，梯度乙醇复水，具体试剂及处理时间见下表1。
59.表1
（5）ddh2o清洗3次，每次3min。
60.（6）高压法抗原修复。将切片置于含有抗原修复液（0.01m ph=9柠檬酸盐缓冲液）的不锈钢筒中，高压锅装水煮沸，沸腾后将带有切片和抗原修复液的不锈钢筒放入高压锅，合盖并把压力调至70kpa，继续加热至喷气然后计时5min，泄压后保持合盖20-30min，计时结束后取出不锈钢筒冷却至常温。
61.（7）ddh2o洗涤3次，每次3min。
62.（8）0.01m pbst洗涤5min。pbst为含有0.1%吐温20的磷酸盐缓冲液。
63.（9）灭活酶试剂避光处15min，灭活内源性辣根过氧化物酶。灭活酶试剂为3%的过氧化氢-甲醇。
64.（10）封闭液37℃封闭30min。封闭液为用pbst稀释牛血清（bsa）至5%bsa-pbst（11）用抗体稀释液将e-cadherin antibody（affinity biosciences，usa）1：400稀释后滴加在切片上，4℃避光孵育过夜。
65.（12）将切片置于室温，避光复温40min。
66.（13）用鼠兔通用二抗滴加在切片上，于37℃孵育1h，0.01mpbst避光洗涤5min。
67.（14）用信号放大液稀释tsa单色荧光染料570，然后将染料滴加在切片上避光显色30-60min。信号放大液和tsa荧光染料均来自五色多重荧光免疫组化染色试剂盒（absin，china）。
68.（15）0.01m pbst避光洗涤10min。
69.（16）即用型dapi染液滴加在切片上染色数十秒，将细胞核染成蓝色。
70.（17）用抗荧光淬灭封片剂封片，用bx53f荧光显微镜（olympus，japan）拍照观察。
71.（18）如图2所示，cdh1蛋白阳性信号的分布与cdh1基因相似，淡水花鲈cdh1蛋白主要分布在鳃小片上皮（顶部、中部、底部）及相邻鳃小片之间的鳃丝上皮，而在海水花鲈鳃组织中，cdh1蛋白的分布位置明显下移，仅分布于鳃小片底部及相邻鳃小片之间的鳃丝上皮。
72.实施例3 通过实时荧光定量技术检测花鲈鳃cdh1基因的表达量利用primer-blast和primer5.0软件设计花鲈cdh1基因的特异性引物，引物序列为：f： atgatggacaccagggc；r：cagtgaggtcaggaata。通过steponeplustm real-time pcr 系统（applied biosystems, usa），以花鲈18s作为内参基因，18s的引物序列为：f：gggtccgaagcgtttact；r：tcacctctagcggcacaa。按照 chamqtmsybr
®ꢀ
color qpcr master mix（high rox premixed）试剂盒（vazyme，china）的操作要求检测花鲈cdh1基因在海淡水
中的相对表达水平。qpcr反应体系如表2；表2qpcr反应程序为：95℃ 30s；95℃ 10s，60℃ 30s，72℃ 30s，40个循环。采用2
－δδct
法计算花鲈cdh1基因的相对表达水平。
73.如图3所示，淡水花鲈鳃中的cdh1基因表达量显著高于海水花鲈。
74.综上，本发明提供一种鉴定海水花鲈、淡水花鲈的方法及应用，一方面可以从定性角度鉴定两类花鲈，即根据cdh1/cdh1的分布定位，淡水花鲈的cdh1基因和蛋白主要分布在鳃小片上皮（顶部、中部、底部）及相邻鳃小片之间的鳃丝上皮，而海水花鲈的cdh1基因和蛋白仅分布鳃小片底部及相邻鳃小片之间的鳃丝上皮，另一方面也可以从定量的角度鉴定两类花鲈，即根据cdh1基因的相对表达量，淡水花鲈鳃中的cdh1基因表达量显著高于海水。
75.以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应局限于该实施例所公开的内容。因此凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。
76.表3表4
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其同物界定。