交叉协同自组装体

本技术根据35 u.s.c.§119(e)要求于2016年8月2日提交的美国临时申请号62/370,098的权益，该美国临时申请号62/370,098的全部内容通过引用合并于本文中。联邦资助的研究本发明是在政府的支持下在由海军研究所提供的基金1435964的资助下完成的。政府对本发明拥有一些权利。

背景技术：

1、实际上，生物分子要通过分子间相互作用组装成层级结构。在合成生物学中，有可能合理地利用层级结构设计生物合成结构单元，所述层级结构来自于固有功能性，在分子水平控制分子间相互作用。这样的生物合成自组装结构例如在纳米技术领域中具有有用的应用。

技术实现思路

1、在一些实施方案中，本文提供了用于控制分子结构的成核和层级组装(可编程自组装)的技术(包括，例如，方法、组合物和试剂盒)，所述分子结构诸如核酸(例如，dna)和/或蛋白质纳米结构、微观结构和宏观结构。此技术在本文中称为“交叉协同组装”，其可以用来编程和迅速地组装仅来源于所提供的大分子“种子”的结构，由此可以被认为是“0背景”组装方法。通过设计单个生物分子亚单位(所述生物分子亚单位要求同时与大量的其他亚单位接合从而实现稳定的附着)上的协同结合位点，该体系对结构的自发成核施加了固有的高能垒，甚至在高浓度的各个单一成分的存在下也施加。成核作用可以仅通过提供大分子“种子”来触发，所述大分子“种子”类似于预先存在的结构界面(呈现用于稳定地俘获下一个亚单位的多个弱结合位点)。添加可以稳定地俘获单个亚单位的种子有效地绕过了对抗自发成核的活化能垒，从而驱动微尺度结构的高阶组装。多种组分可以持续地添加到所述结构，使得它们在一维、二维或三维上的生长潜在地与用于其他聚合或结晶过程的生长一样大。

2、如本文所提供的交叉协同组装使用分子(例如，核酸或蛋白质)结构单元(图1a)，所述结构单元被编程从而自组装成交叉层(图1b)。在一些实施方案中,结构单元可以是由可编程的核酸杂交相互作用组装而来的棒状结构。如上所示，此交叉协同组装技术使用“种子”结构，可编程的核酸自组装从所述“种子”结构开始。此种子结构通过成核结构(图1a；“蜂王”)和一个亚组的结构单元(图1a；“雄蜂”)之间的不可逆相互作用而形成，所述亚组的结构单元排列成行以沿成核结构形成初始种子层。在种子结构的存在下，向已存在的种子层(图1b)添加另一组结构单元(图1a；‘工蜂’)。足够数量的结构单元(雄蜂)和成核结构(蜂王)之间的结合形成种子可以触发许多额外的结构单元(工蜂)层的加入，每个层相对于邻近的(上面的和/或下面的)层旋转一定的度数(例如，90°)。

3、成核结构和结构单元被构造成基于如下的一组动力学/成核能量参数彼此相互作用(例如，结合)。初始亚组的结构单元(雄蜂)应当强力(不可逆转地/稳定地)结合并且形成沿成核结构(蜂王)的取向层。初始亚组的结构单元(雄蜂)应当彼此不相互作用(结合)。同样，后续亚组的结构单元(工蜂)应当彼此不相互作用(结合)。此外，在缺少成核结构(蜂王)的情况下，来自初始亚组的任何结构单元(雄蜂)应当与来自另一亚组的结构单元(工蜂)仅具有一种弱(可逆的)相互作用。在成核结构(蜂王)的存在下，来自初始亚组的单一结构单元(雄蜂)可以与来自后续亚组的多于一个的结构单元(工蜂)相互作用，并且来自后续亚组的单一结构单元(工蜂)可以与来自初始亚组的多于一个的结构单元(雄蜂)或另一亚组的多于一个的结构单元(另一亚组的‘工蜂’)相互作用。例如，参照图1b，单一结构单元(例如，dna纳米棒)可以与8个其他的结构单元(例如，dna纳米棒)结合，尽管该单一结构单元与8个结构单元中的每一个仅结合一次从而形成具有“交叉”图案的两个层。

4、来自初始亚组的结构单元(雄蜂)和来自后续亚组的结构单元(工蜂)之间的单一相互作用应当足够弱，使得在缺少种子结构的情况下(大量的单个工蜂将不得不同时聚拢到一起)存在对成核作用的任意大的熵惩罚。利用这些参数，可以实现零背景和最小缺陷，甚至在高浓度的相互作用的结构单元下也可以实现，由此能够使核酸纳米结构快速地成核和组装。

5、因此，本文提供了组合物，所述组合物包含：(a)成核的核酸纳米结构；(b)第一层平行的细长核酸纳米结构，所述第一层平行的细长核酸纳米结构稳定地结合于(a)的成核的纳米结构；和(c)第二层平行的细长核酸纳米结构，所述第二层平行的细长核酸纳米结构稳定地结合于(b)的细长纳米结构并且相对于(b)的平行的细长纳米结构成角度地旋转，其中(b)的单个细长纳米结构与(c)的多个细长纳米结构各自通过单个协同结合位点结合。在一些实施方案中，(c)的单个细长纳米结构与(b)的多个细长纳米结构各自通过单个协同结合位点结合。

6、本文在一些方面还提供了组合物，所述组合物包括：(a)成核的纳米结构；(b)第一亚组的细长纳米结构，其中少于10％的(b)的纳米结构彼此结合，并且其中(b)的纳米结构可逆地结合于(a)的成核纳米结构；和(c)第二亚组的细长纳米结构，其中少于10％的(c)的纳米结构彼此结合，其中在缺少成核的纳米结构的情况下，(b)的纳米结构可以仅在(a)的纳米结构上的单个位置处可逆地结合于(a)的纳米结构，并且其中，在缺少成核的纳米结构的情况下，(a)的纳米结构可以仅在(b)的纳米结构上的单个位置处可逆地结合于(b)的纳米结构。参见，例如，图1a-1b。

7、在一些实施方案中，本文还提供了交叉核酸纳米结构，所述交叉核酸纳米结构包括：第一纳米棒，所述第一纳米棒包括第一插头链和第二插头链；第二纳米棒，所述第二纳米棒包括第三插头链和第四插头链,其中所述第二纳米棒平行于所述第一纳米棒；第三纳米棒，所述第三纳米棒包括与所述第一插头链互补并结合的第五插头链和与所述第二插头链互补并结合的第六插头链；第四纳米棒，所述第四纳米棒包括与所述第三插头链互补并结合的第七插头链和与所述第四插头链互补并结合的第八插头链，其中所述第三纳米棒平行于所述第四纳米棒。参见，例如，图18。交叉纳米结构不限于4个纳米棒，并且在许多实施方案中，包括以如本文所述的交叉图案配置的至少4个(例如，至少5、10、15、20、25、50、100或更多个)纳米棒。

8、因此，在一些实施方案中，交叉核酸纳米结构包括彼此平行的第一多个纳米棒，和彼此平行的第二多个纳米棒，其中所述第一多个的纳米棒与所述第二多个的纳米棒结合并垂直(或不平行)。参见，例如，图18。

9、在一些实施方案中，每个纳米棒由dna组成。例如，纳米棒可以由6-螺旋dna束组成(参见，例如，douglas sm1,chou jj,shih wm.dna-nanotube-induced alignment ofmembrane proteins for nmr structure determination(dna-纳米管诱发的膜蛋白对齐用于确定nmr结构).proc natl acad sci u s a.104,6644–6648,2007,通过引用并入本文)。

10、在一些方面本文还提供了交叉核酸板条，所述交叉核酸板条包括：第一多个的彼此平行的至少四条核酸链，所述第一多个的每条链的长度为20-100个核苷酸(例如，20-30、20-40或20-50个核苷酸)；和第二多个的彼此平行的至少四条核酸链，所述第二多个的每条链的长度为20-100个核苷酸(例如，20-30、20-40或20-50个核苷酸),其中所述第一多个的至少四条核酸链与所述第二多个的至少四条核酸链结合并垂直。参见，例如，图21a-21b。

11、在一些方面本文中还提供了交叉核酸板条，所述交叉核酸板条包括：第一多个的彼此平行的至少四条核酸链，所述第一多个的每条链的长度为至少21个核苷酸；和第二多个的彼此平行的至少四条核酸链，所述第二多个的每条链的长度为至少21个核苷酸,其中所述第一多个的至少四条核酸链与所述第二多个的至少四条核酸链结合并垂直。参见，例如，图21a-21b。

12、在一些方面，本文进一步提供了核酸纳米结构，所述核酸纳米结构包括折叠成由较短的核酸订书钉链(staple strand)固定的重复的环状形状(例如，5-15个环，或5、6、7、8、9或10个环)的核酸支架链(例如，m13或m13-衍生的)，其中所述重复的环结构与至少一个(例如，至少2、3、4、5、10、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多个)交叉核酸板条结合。参见，例如，图22,24a,25和27b。

13、在一些方面，本文进一步又提供了核酸纳米结构，所述核酸纳米结构包括折叠成由至少两个交叉核酸板条固定的重复的环状形状的核酸支架链。参见，例如，图27b和28b。

14、本公开在一些方面还提供了制备交叉核酸纳米结构的方法，该方法包括：在反应混合物中混合(a)第一纳米棒，所述第一纳米棒包括第一插头链和第二插头链，(b)第二纳米棒，所述第二纳米棒包括第三插头链和第四插头链，其中所述第二纳米棒平行于所述第一纳米棒；(c)第三纳米棒，所述第三纳米棒包括与所述第一插头链互补并结合的第五插头链和与所述第二插头链互补并结合的第六插头链；和(d)第四纳米棒，所述第四纳米棒包括与所述第三插头链互补并结合的第七插头链和与所述第四插头链互补并结合的第八插头链，其中所述第三纳米棒平行于所述第四纳米棒；以及在产生交叉核酸纳米结构的组装体的条件(例如，核酸杂交条件)下孵育所述反应混合物。参见，例如，图22。

15、在一些方面，本文还提供了生物分子(分析物)检测方法。在一些实施方案中，一种方法，其包括(a)在反应混合物中混合：(i)包含生物分子的样品；(ii)能够自组装成包含垂直堆叠的平行链的纳米结构的核酸链；(iii)比(ii)的核酸链短的多个寡核苷酸，其中(iii)的寡核苷酸与(ii)的链结合以组装所述垂直堆叠的平行链；(iv)两个交叉核酸板条，其中所述两个板条与(ii)的链结合，并且其中每个板条与生物分子结合伴侣连接，所述生物分子结合伴侣特异性地结合样品中的生物分子；(b)在允许所述生物分子结合伴侣与生物分子结合和所述纳米结构组装成垂直堆叠的平行链的条件下孵育所述反应混合物；(c)将(iii)的多个寡核苷酸从(b)的反应混合物中移除；(d)在多个权利要求27所述的交叉核酸板条的存在下孵育(c)的反应混合物，其中所述交叉核酸板条与所述垂直堆叠的平行链结合以形成三维圆筒结构。在一些实施方案中,所述方法进一步包括对所述三维圆筒结构成像。参见，例如，图28a-28b。

16、在一些实施方案中,所述方法可以包括在反应混合物(例如，利用杂交缓冲液)中混合：(a)包含生物分子的样品和(b)核酸纳米结构，所述核酸纳米结构包括：(i)能够折叠成重复的环状形状(例如，2-15个垂直堆叠的环)的核酸支架链和(ii)两个交叉核酸板条，其中特异性地结合所述生物分子的生物分子结合伴侣(例如，抗体)与每个所述交叉核酸板条连接，使得在所述相关生物分子的存在下，所述生物分子结合伴侣与所述生物分子结合，并且所述核酸纳米结构折叠成重复的环状形状。参见，例如，图28a-28b。

17、在一些实施方案中,所述方法进一步包括将所述反应混合物与多个(例如，2-50个或2-100个)交叉核酸板条混合以形成三维圆筒样结构。参见，例如，图24b。

18、应当理解的是如本文所述的核酸纳米结构(例如，纳米棒、板条、圆筒，等等)及其变体，如本文所提供的，可以例如使用下列的公共可获得的工具来设计，所述工具由douglas sm,marblestone ah,teerapittayanon s,vazquez a,church gm,shih wm.rapidprototyping of 3d dna-origami shapes with cadnano(利用cadnano对3d dna-折纸形状进行快速原型制造).nucleic acids res.37,5001–5006,2009(通过引用并入本文)所述。还参见，douglas等人，nature,459(7245):414-418,2009,该文通过引用并入本文。例如，并且如本文其他地方所述，在本领域中已知可以使用长“支架”链作为模板将几百条寡核苷酸“订书钉”链的组装体形成为交联螺旋的平面逆平行阵列来产生定制形状(例如，兆道尔顿尺度)dna纳米结构。这种“支架dna折纸术”方法也已经被适应性地改动以产生成形为被约束成蜂窝晶格的双螺旋的折叠层的3d形状。cadnano(一种具有图形用户界面的开源软件包)可以用来辅助设计用于折叠3d dna(或其他核酸)纳米结构的dna序列。cadnano软件与实例设计和证明其构造的视频辅导材料可获自cadnano.org。