与黄瓜叶片黄化突变紧密连锁的InDel3分子标记及其应用

与黄瓜叶片黄化突变紧密连锁的indel3分子标记及其应用
技术领域
1.本发明涉及黄瓜遗传育种和分子生物学技术领域，具体涉及一种与黄瓜叶片颜色紧密连锁的indel3分子标记及其应用。


背景技术：

2.叶片是植物光合作用的重要器官，也是植株形态建成和果实生长的重要基础。植物通过光合作用吸收光能和二氧化碳，将无机物转化为有机物贮存，并维持植物生长必须的养分需求，以及稳定生态系统平衡的需要。而叶片作为光合作用的直接载体，对植物的生长发育以及能量转换尤为重要。一般植物叶片因含有大量光合色素而使其呈现绿色，维持光合作用的进行以及能量的转化。因此，光合色素是光合作用重要的基础，在光合作用中起着十分重要的作用，是光能吸收和转换的平台。
3.叶片是植物光合作用的重要场所，而叶绿素含量、叶绿体结构和叶绿体相关基因表达与光合作用密切相关。在一定条件下，植物发生叶绿体突变，将改变叶片中叶绿素含量，从而产生不同叶色表型。在科研工作中，利用叶色突变体进行基因的挖掘和光合作用机理的研究，对明确基因的调控功能和光合作用的分子机制都具有重要意义。
4.随着黄瓜基因组测序的完成，与黄瓜重要农艺性状相关基因的定位报道增加，这些研究为重要性状调控基因的挖掘及进行分子育种提供了新的思路。在自然条件下或者人工诱发等条件下，黄瓜常常发生各种各样的突变，其中比较常见的一种突变是叶色突变，也是自然界比较普遍的突变现象，这些突变体是研究植物光合作用机制、光形态建成、叶绿素代谢、叶绿体结构功能及遗传发育调控机理的重要材料，也是分析鉴定基因功能，了解基因互作与表达调控的理想材料。在育种过程中，黄瓜叶色突变可作为性状标记在良种繁育和杂交育种中进行应用，在杂种一代的选择中可以极大地提高鉴定效率。这不仅操作简便，程序简单和结果直观，还可以大大地降低育种成本以及育种周期。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明涉及一种与黄瓜叶片黄化突变紧密连锁的indel3分子标记及其应用。利用该标记对黄瓜叶色黄化突变和杂合位点进行快速检测，通过与indel3分子标记的关联可在种子时期快速确定黄瓜植株叶色的表型、进而实现快速辅助育种以及黄瓜种质选育，筛选带有隐性基因的杂合株；筛选黄瓜具有特异光合作用特性的种质材料，为黄瓜辅助育种提供理论依据和应用指导。
6.为解决现有技术存在的问题，本发明的技术方案是：与黄瓜叶片黄化突变紧密连锁的indel3分子标记，其特征在于：所述indel3分子标记位于黄瓜gy14基因组dna第7号染色体indel21和ssr20583标记之间的18.6kb区间内，在染色体上的物理位置在1245674-1226636bp之间。
7.所述indel3分子标记是基于黄瓜gy14基因组dna第1239217bp处有5bp的碱基插入进行开发的，该插入的核苷酸序列为seq id no：1所示的核苷酸序列：ctgag。
8.所述indel3分子标记引物包括上游引物indel3-f：5
’‑
cac cac gct cag gat tca gat g-3’和下游引物indel3-r：5
’‑
tct taa atc ata ccc agt aga cca gg-3’。
9.所述分子标记用于快速检测黄瓜叶色黄化和杂合位点中的应用。
10.所述的分子标记用于黄瓜叶色黄化和杂合位点快速检测方法，其特征在于：方法为：
11.待测黄瓜材料的全基因组dna提取；根据indel3分子标记引物对进行pcr扩增；具有黄色叶片表型的单株通过pcr扩增产生526bp单一特征条带；具有绿色叶片表型的纯合单株产生531bp的单一特征条带；正常绿色叶色但该位点为杂合基因型时，pcr扩增获得526bp和531bp的两条特征条带。
12.与现有技术相比，本发明的优点如下：
13.1、本发明提供了一种与黄瓜叶片黄化突变紧密连锁的indel3分子标记，该indel3分子标记位于黄瓜gy14基因组dna第7号染色体indel21和ssr20583标记之间的18.6kb区间内，物理位置在1245674-1226636bp之间。
14.2、本发明通过indel3分子标记的pcr扩增产物的带型，能够准确鉴定黄瓜的叶片黄化和绿色的表型。具有黄色叶片表型的单株通过pcr扩增可产生526bp单一特征条带；具有绿色叶片表型的纯合单株可产生531bp的单一特征条带；正常绿色叶色杂合基因型时，pcr扩增获得526bp和531bp的两条特征条带。
15.3、本发明的鉴定方法可用在种子时期进行鉴定，简单方便操作，能大幅提高育种效率。为进一步加快分子标记在育种中的应用提供了理论依据。
附图说明
16.图1为对黄瓜叶色黄化候选基因的精细定位结果。
17.图2为利用分子标记indel3进行pcr扩增时的电泳图。其中，1代表绿叶自交系gy14，2代表黄叶突变体材料。
具体实施方式
18.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
19.应用本发明的indel3分子标记进行辅助育种时，不需要经过苗期鉴定，用种子即可准确快速的进行鉴定，可以提高育种效率，缩短鉴定时间，同时减少工作量和降低生产成本，尤其是通过分子标记进行检测，方法准确可靠，操作简便，为快速鉴定育种材料和品种选育提供了技术基础，对加速育种进程具有十分深远的理论意义和重要的应用价值。
20.本发明旨在开发一个与黄瓜叶片黄化突变紧密连锁的indel3分子标记，其采用的方法步骤为：
21.步骤1.选择黄瓜正常叶色为绿色的自交系gy14为父本；黄瓜叶片黄化的突变体yf为母本，构建分离群体，并进行叶色分离规律的调查及叶色黄色突变的精细定位，确定叶色黄色突变性状的候选基因位于第7号染色体indel21和ssr20583标记之间的18.6kb区间内，物理位置在1245674-1226636bp之间。
22.步骤2.通过对双亲的序列分析可知，根据gy14的dna基因组第7染色体的第1239217bp处存在5bp的ctgag序列插入；
23.步骤3.根据插入序列设计标记indel3。该引物由一对pcr扩增用的上游引物indel3-f和下游引物indel3-r组成，具体而言：indel3-f:5
’‑
cac cac gct cag gat tca gat g-3’，indel3-r:5
’‑
tct taa atc ata ccc agt aga cca gg-3’；
24.步骤4.f 2
单株可通过标记indel3进行pcr扩增区分，具有黄色叶片表型的单株通过pcr扩增可产生526bp单一特征条带；具有绿色叶片表型的纯合单株可产生531bp的单一特征条带；正常绿色叶色杂合基因型时，pcr扩增获得526bp和531bp的两条特征条带。
25.以下是与黄瓜叶片黄化突变紧密连锁的indel3分子标记开发的具体步骤：
26.1、实验操作
27.(1)dna提取
28.采集黄瓜自交系gy14(叶色为绿色)、黄瓜黄化突变体材料(叶色为黄色)两个亲本以及由两个亲本杂交获得的f2分离群体单株的嫩叶，使用ctab法提取植株总dna。ctab的配制方法为20g ctab、81.9g nacl、7.46g edta na2·
2h2o、0.8g nacl、12.14g tris碱和2g pvp，溶解定容至1l。采集1g左右植物组织鲜样于灭菌的2ml离心管里，放入液氮中冷冻并研磨，提取后采用nanodrop微量紫外分光光度计测定浓度。
29.(2)叶色分离情况观察：对双亲及f1及f2代的叶色进行观察。随机选取593株f2利用卡方检测对叶色分离进行鉴定，并进行卡方检验。
30.(3)定位：以提取的f2群体dna为模板，利用筛选出的ssr引物进行pcr扩增，pcr反应总体系为10μl，包括模板dna 1μl、10ng/μl引物(上游+下游)各0.5μl、ddh2o 4μl、2
×
taq pcr master mix 4μl；pcr反应程序：94℃变性5min；94℃变性30sec、55℃退火30sec、72℃延伸30sec，32个循环；72℃延伸10min；4℃保存。使用9％的聚丙烯酰胺凝胶对ssr标记进行扩增片段鉴定。利用joinmap软件并且计算连锁标记与突变体基因之间的重组值和遗传图距遗传距离。
31.(4)重测序和序列比对
32.利用illumina hi-seq2000高通量测序平台对yf突变体材料进行重测序，测序深度》20
×
；以已公布的黄瓜gy14全基因组序列(http://cucurbitgenomics.org/organism/16)初步定位的区段作为参考序列，利用igv_2.11.1软件将yf亲本的重测序序列和gy14候选区段进行比对，寻找两个亲本在候选区段的差异片段。
33.(5)序列比对及差异序列确定
34.通过候选区段差异序列比对，筛选具有3个碱基差异以上的插入或缺失位点。
35.(6)indel标记的设计及多态性筛选
36.根据碱基的缺失和插入情况，利用primer5软件设计合成14对indel分子标记。并在亲本间进行所设计的indel引物的多态性筛选，选择具有稳定清晰且具有大小差异扩增条带的引物入选。
37.(7)在扩大的f2群体中检验indel分子标记与目标性状之间的连锁关系
38.将f2作图群体进一步扩大到1200株，利indel8、ssr20583和两个标记之间新增indel3标记对该群体进行筛选，寻找重组单株。检测新增indel3分子标记和目标性状之间的连锁关系。
39.(8)所筛选出的indel3标记在绿叶和黄叶单株中特征条带的确定。利用筛选出的indel3分子标记在亲本和f2个体中进行pcr扩增，确定绿色叶片单株和黄色叶片单株的特征条带。
40.2、实验结果与分析
41.(1)叶色分离情况观察及初定位：对双亲及f1及f2代的叶色进行观察。随机选取593株f2利用卡方检测对叶色分离进行鉴定，鉴定结果表明，593株f2群体，其中绿色叶色表型452株，黄色叶色表型141株，经卡方验证χ2＝0.261，符合3：1的分离比。说明黄瓜叶色黄化性状是由1对隐性核基因控制。
42.(2)采用bsa法进行多态性分子标记筛选及初步定位
43.筛选结果共发现4对分子标记在两个池间显示多态。利用joinmap软件并且计算连锁标记与突变体基因之间的重组值和遗传图距遗传距离，确定候选基因初步定位于indel8和ssr20583之间123.96kb区间内，遗传距离分别为6.4cm和2.9cm(如图1所示)。
44.(4)yf突变体重测序和亲本基因组比对
45.在ssr标记ssr20583和ssr10066之间的区段作为参考序列，利用igv_2.11.1软件将突变体亲本的重测序序列和gy14候选区段进行比对，寻找两个亲本在候选区段的差异片段。
46.(5)与叶色黄化基因yf紧密连锁的indel分子标记开发
47.通过候选区段差异序列比对，选择具有3个碱基差异以上的插入或缺失位点，利用primer5软件设计合成了14对indel分子标记。
48.将这14个indel标记在亲本间进行了多态性筛选，筛选结果显示indel3在两个亲本之间具有稳定清晰且具有大小差异的扩增条带。indel3分子标记是根据黄瓜gy14基因组dna第1239217bp处5bp的核苷酸序列ctgag插入进行设计的。
49.标记的上下游引物为：
50.indel3-f:5'-caccacgctcaggattcagatg-3'
51.indel3-r:5'-tcttaaatcatacccagtagaccagg-3'。
52.(6)indel3和目标性状的紧密连锁关系的确认
53.将f2作图群体进一步扩大到1000株，利用ssr20583、ssr10066和indel3标记对该群体进行筛选，寻找重组单株。分析结果显示，ssr20583分子标记与yf基因之间存在4个重组单株，ssr10066分子标记与yf基因之间存在8个重组单株，而indel3分子标记与yf基因之间高度连锁，无重组单株出现，如图1所示。
54.(7)indel3分子标记对在绿叶和黄叶单株中特征条带的确定
55.对indel3在两个亲本和f2群体中扩增产物进行电泳检测，结果如图2所示。利用分子标记indel3对黄化叶色单株的基因组dna进行扩增时，获得526bp的紧密连锁的单一特征条带；利用分子标记indel3对正常绿色叶色纯合基因型时，pcr扩增获得531bp的紧密连锁的特征条带；利用分子标记indel3定位正常绿色叶色杂合基因型时，pcr扩增获得526bp和531bp的紧密连锁的两条特征条带。