家蚕Cyp9a20基因及其应用

家蚕cyp9a20基因及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及cyp9a20在抗家蚕核型多角体病毒bmnpv中的应用。


背景技术：

2.家蚕是一种重要的经济昆虫，蚕丝是丝绸工业的重要原料。但是，家蚕却面临严重的疾病威胁，核型多角体病毒病是蚕业生产上最常见而且危害最严重的一类蚕病，引起该病的病原为核型多角体病毒(bmnpv)，该病的传染力极强并且难以控制。
3.由于bmnpv在蚕业生产上危害严重，科研工作者一直希望找出影响家蚕对病毒抗性的关键基因，然后通过分子生物技术来提高家蚕对病毒的抗性。对影响家蚕病毒抗性的关键基因全长序列进行克隆和鉴定，为阐明家蚕抵抗病毒的机制，以及培育抗性品种应用于蚕业生产有着重要的理论价值和实践意义。
4.公开号为cn106834298a的中国专利，鉴定了家蚕抗性关键基因bmst，利用家蚕dz品种制备了增量表达bmst的转基因家蚕品系a4st，在感染bmnpv和bmcpv后，a4st家蚕的死亡率显著低于dz对照。但是该基因是如何作用，是否有其他抗病毒基因目前并不清楚。因此，亟需鉴定其他的家蚕抗性关键基因，对培育抗性品种具有重要意义。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的之一在于提供家蚕cyp9a20基因，本发明的目的之二在于提供所述家蚕cyp9a20基因在制备家蚕抗病毒药物中的应用；本发明的目的之三在于提供增量表达cyp9a20在制备抗家蚕核型多角体病毒bmnpv的转化体中的应用。
6.为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
7.1、家蚕cyp9a20基因，所述家蚕cyp9a20基因的编码的氨基酸如seq id no.10所示。
8.优选的，所述家蚕cyp9a20基因的核苷酸序列如seq id no.9所示。
9.2、所述家蚕cyp9a20基因在制备家蚕抗病毒药物中的应用，所述cyp9a20的核苷酸如seq id no.9所示。
10.本发明优选的，所述病毒为家蚕多角体病毒bmnpv。
11.3、增量表达所述cyp9a20基因在制备抗家蚕病毒的转化体中的应用，所述cyp9a20的核苷酸如seq id no.9所示。
12.本发明优选的，所述增量表达cyp9a20的方法是构建表达cyp9a20基因的重组载体，然后转化入受体细胞，获得转化体。
13.本发明优选的，所述重组载体中cyp9a20基因由家蚕肌动蛋白actin 4启动子和sv40终止信号序列调控表达。
14.本发明优选的，所述转化体为家蚕细胞或家蚕个体。
15.本发明的有益效果在于：本发明公开了cyp9a20基因，该基因对家蚕病毒具有抑制
作用，通过对增量表达bmst的转基因家蚕和对照家蚕进行转录组测序，从差异表达基因中分析筛选到下游候选基因cyp9a20；进一步qpcr检测结果表明cyp9a20受bmst的调控；增量表达cyp9a20可以显著抑制bmnpv的增殖。因此，cyp9a20在家蚕抗病毒分子育种的研究和应用中具有重要价值，可通过转增量表达该基因来提高家蚕抗病毒能力。
附图说明
16.为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
17.图1为bmst和cyp9a20的转录组结果(a)及定量pcr检测(b)；
18.图2为cyp9a20是bmst的下游基因(a：增量表达bmst后，qpcr检测bmst和cyp9a20的表达量；b：增量表达cyp9a20后，qpcr检测cyp9a20和bmst的表达量)。
19.图3为在bme细胞中增量表达cyp9a20基因显著抑制bmnpv增殖(a：转染后48h pcr检测cyp9a20基因表达量；b：感染病毒后48h qpcr检测bmnpv病毒含量；c：感染病毒后72h观察bmnpv病毒荧光)。
具体实施方式
20.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
21.实施例1、增量表达bmst的转基因家蚕a4st的转录组测序及分析
22.(1)取a4st和对照dz的5龄起蚕攻毒，在感染bmnpv后的12、24h，感染bmcpv后的24、72h，以及不攻毒对照的24、72h，分别收集中肠提取rna(12个中肠样品，各自3个重复，共36个rna样品)，用于转录组测序。将a4st和dz每个时间点的基因表达量进行比对，筛选差异表达基因，对差异表达基因进行go功能注释和kegg通路分析。
23.(2)统计整理各个时间点都上、下调的差异表达基因，发现有157个上调基因和213个下调基因，进而对这些基因的go注释和kegg通路信息进行深入分析，筛选到候选基因cyp9a20。
24.(3)提取转录组数据中的bmst和cyp9a20表达量(fpkm值)进行比对分析(图1，a)，发现两个基因的表达模式几乎一致，都是在a4st中明显高于对照dz；进而利用bmst的特异引物bmstqrt f：5'-acttgagacttcgcaaccca-3'(seq id no.1)，bmstqrt r：5'-tcgcaaagcacgcatacag-3'(seq id no.2)、cyp9a20的特异引物cyp9a20qpcr f：5
’‑
ctacgcattacgctgtttcaa-3’(seq id no.3)；cyp9a20qpcr r：5
’‑
ctcatcgtgcctcaacttg-3’(seq id no.4)、内参基因tif-4a的特异引物tif-4aqrt f：5'-gaatggaccctgggacactt-3'(seq id no.5)，tif-4aqrtr：5'-ctgactgggcttgagcgata-3'(seq id no.6)，对转录组样品的rna进行qpcr检测，结果显示两个基因的表达模式和转录组结果一致(图1，b)，说明转录组结果是可信的。
25.实施例2、cyp9a20的克隆及表达模式分析
26.(1)首先根据家蚕基因组序列设计特异引物cyp9a20 f：5'-ggatccatgattctcctcatttgggccg-3'(seq id no.7)；cyp9a20 r：5'-gcggccgctcaatttctaatcttcagcctga-3'(seq id no.8)，以家蚕5龄3天的全蚕cdna为模板
进行扩增，pcr反应条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、60℃退火40秒、72℃延伸1分20秒，共30个循环，最后72℃延伸10分钟；pcr产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，然后与pmd19-t载体连接，连接反应在t4 dna连接酶作用下，16℃过夜连接，然后转化dh5α感受态细胞，获得阳性克隆后送往上海生工生物技术有限公司测序，测序结果表明成功克隆了cyp9a20基因的cds序列，全长1596bp，核苷酸序列如seq id no.9所示，编码的氨基酸序列如seq id no.10所示。
27.(2)将上一步测序验证成功的质粒用bamh i和not i进行双酶切，经琼脂糖电泳鉴定并回收，得cyp9a20酶切片段；同时用bamh i和not i双酶切已经包含hr3增强子、家蚕肌动蛋白actin 4启动子(a4p)和sv40终止信号序列的1180载体，将cyp9a20替换pb-heag载体的hycu-ep32基因序列(pb-heag载体见蒋亮博士毕业论文《基于转基因工程的家蚕核型多角体病毒(bmnpv)抗性素材创新及抗性机制研究》，2013)，经琼脂糖电泳鉴定并回收，得1180-hr3-a4p-sv40酶切片段。将cyp9a20酶切片段和1180-hr3-a4p-sv40酶切片段进行连接转化，筛选阳性克隆，得到1180-hr3-a4p-cyp9a20-sv40载体(cyp9a20oe)。
28.(3)将保存的1180-hr3-a4p-bmst-sv40载体(简称为bmstoe)(参见公开号为cn106834298a的中国专利)和不含目的基因的1180对照分别转染bme细胞，48h后提取rna进行qpcr检测，发现bmst和cyp9a20的表达量在转染bmstoe的细胞中都显著高于对照(图2，a)；将cyp9a20oe和1180对照分别转染bme细胞，48h后提取rna进行qpcr检测，结果显示，和对照相比，cyp9a20的表达量在转染cyp9a20oe的细胞中显著增加，但bmst的表达量没有明显变化(图2，b)。这些结果表明cyp9a20是bmst的下游基因，且受bmst的调控。
29.实施例3、增量表达cyp9a20抑制bmnpv增殖
30.(1)将cyp9a20oe和对照1180的质粒分别转染进bme细胞，在转染后48h后提取rna并反转录成cdna，用cyp9a20的特异引物cyp9a20qpcr和内参tif-4a的特异引物tif-4aqrt进行rt-pcr检测，结果显示cyp9a20的扩增条带亮度在转染cyp9a20oe的样品中更加明显(图3，a)，表明cyp9a20增量表达成功。
31.(2)在转染后48h感染带有绿色荧光标记的bmnpv-gfp病毒，在感染病毒后48h提取dna，以bmnpv病毒gp41基因的特异引物gp41qrt f：5'-cgtagtagtagtaatcgccgc-3'(seq id no.11)，gp41qrt r：5'-agtcgagtcgcgtcgcttt-3'(seq id no.12)进行qpcr检测，以家蚕看家基因bmgapdh作为内参，其特异检测引物为bmgapdhqrt f：5'-ccgcgtccctgttgctaat-3'(seq id no.13)，bmgapdhqrtr：5'-ctgcctccttgaccttttgc-3'(seq id no.14)，按照仪器和试剂盒的说明书进行操作。qpcr检测结果显示转染cyp9a20oe的细胞能够显著抑制病毒增殖，其bmnpv含量仅为对照的20％(图3，b)。
32.(3)在感染病毒后72h观察荧光，发现转染cyp9a20oe的细胞中病毒荧光明显少于对照(图3，c)，表明增量表达cyp9a20能够抑制bmnpv的增殖。
33.以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。