与小麦茎基腐病抗性QTLQfcr.sicau.2A紧密连锁的分子标记及应用

本发明涉及分子标记和植物遗传育种，具体地说，涉及一种与小麦茎基腐病抗性qtl qfcr.sicau.2a紧密连锁的分子标记及应用。

背景技术：

1、小麦(triticum aestivum l.)是世界上最为重要的主粮作物之一，小麦为人类提供了膳食纤维和多种营养物质，世界约40％人口以小麦作为重要的热量来源。小麦的安全生产对中国粮食安全具有重要意义。小麦茎基腐病(fusarium crown rot,fcr)是一种多种病原菌侵染引起的、一种世界性真菌病害，该病发生严重时极大降低谷物的产量和品质。抗病品种的选育和大规模应用是控制该病害最经济和有效的途径，抗源的使用和茎腐病抗性鉴定技术是保证抗病品种选育的关键。

2、目前抗茎基腐病的qtl分布在小麦的21条染色体中的14条上，但只有2d、3b和5d上的qtl可以在不同的遗传背景中被一致地检测到；wallwork等(2004)使用了来自“kukri/janz”杂交的由单倍体加倍获得的双倍体(dh)群体，利用室外环境检测成株期的抗性，检测到矮化基因rht1附近的4b qtl，该基因座的抗性等位基因来自“kukri”品种，解释了高达48％的表型变异率(wallwork,h.,m.butt,et al.resistance to crown rot in wheatidentified through an improved method for screening adultplants.australas.plant pathol.2004,33:1-7.)；bovill(2006)等利用95份来自“w21mmt70/mendos”杂交的由单倍体加倍获得的双倍体(dh)群体利用温室环境在幼苗期进行鉴定，检测到分别来自“w21mmt70”、“mendos”抗性基因的两个位于5d和2b的qtl，解释了28％和20％的表型变异率(bovill,w.d.,w.ma,et al.identification of novel qtl forresistance to crown rot in the doubled haploid wheat population‘w21mmt70’9‘mendos’.plant breed.2006,125,538-543.)；ma等(2010)分析了“cscr6”与澳大利亚品种“lang”之间的杂交获得的群体，通过苗期温室接种鉴定qtl之一的抗性等位基因源自“cscr6”，称为qcrs.cpi-3b的qtl位于3b染色体的长臂上，根据区间作图分析可解释多达48.8％的表型变异，为迄今为止具有最大效应的qtl位点，另一个具有来自“lang”品种的抗性等位基因的qtl位于4b染色体上，这个qtl解释多达22.8％的表型变异，可在不同遗传背景中检测到(ma,j.,h.b.li,et al.identification and validation of a major qtlconferring crown rot resistance in hexaploid wheat.theor.appl.genet.2010,120,1119-1128.)；zheng等(2014)针对ril群体的“egawylie/'sumai 3”的研究发现了四个qtl赋予茎基腐病抗性，影响最大的一个位于染色体臂5ds上，该qtl解释了高达31％的表型变异，lod值为9.6，另一个qtl位于2dl上，该qtl解释了高达20％的表型变异，lod值为4.5。当通过协方差分析考虑植物高度的影响时，未检测到其他两个基因座(均位于4b染色体上)的显着影响(zheng z,kilian a,yan g,et al.qtl conferring fusarium crown rotresistance in the elite bread wheat variety ega wylie.plos one.2014,9:e96011.)。

3、西藏半野生小麦(t.aestivum ssp.tibetanum)、云南铁壳麦(t.aestivumssp.yunnanense)、新疆稻麦(t.petropavlovskyi udacz et.migusch)和四川白麦子是中国西部特有地方小麦种质资源(ward,r.w.,yang,z.l.,kim,h.s.,et al.comparativeanalyses of rflp diversity in landraces of triticum aestivum and collectionsof t.tauschii from china and southwest asia.theor.appl.genet.1998,96:312-318.)。这四个种质资源是由原始六倍体小麦在长期的中国特有的生态环境中通过自然和人工选择在不同的生态环境中进化而来的；具有丰富的农艺性状和遗传多样性，是丰富小麦遗传变异的潜在基因资源(dong,y.,zheng,d.,qiao,d.,zeng,x.,en,z.,chen,x.1981.expedition and investigation of yunnan wheat(triticum aestivumssp.yunnanense king).zuo wu xue bao 3:145-152.)。因此，对209份中国西部特有地方小麦进行全基因组关联分析，进一步定位小麦茎基腐病抗性位点，挖掘高抗茎基腐病的基因，寻找紧密连锁的分子标记，同时为小麦高抗茎基腐病材料的创制及高产育种提供新基因资源，进一步利用分子标记辅助选择，将增强茎基腐病抗病性预测的准确性，提高育种效率，加速实现培育抗病高产的小麦。

4、分子标记辅助选择，不依赖于表现型选择，即不受环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素的影响，而是直接对基因型进行选择，因而能大大提高育种效率。竞争性等位基因特异性pcr(kompetitive allele specific pcr)，可在广泛的基因组dna样品中，对snp和特定位点上的indel进行精准的双等位基因检测。这种检测方法具有操作简便、特异性好、高通量、快速、检测成本低、结果准确等优势，并且实现了真正的闭管操作而受到普遍的关注。因此，筛选出与小麦茎基腐病抗性qtl紧密连锁的，且适用于荧光定量pcr平台kasp技术的分子标记，不仅能对小麦茎基腐病抗性基因进行选择，有效的提高小麦的抗病性，保障小麦正常生长结实，同时提高了选择通量、速度和准确性，解决了大规模推广应用的技术瓶颈，对规模化改良小麦育种群体质量和产量具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种与小麦茎基腐病抗性qtl qfcr.sicau.2a紧密连锁的分子标记及应用。

2、为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种与小麦茎基腐病抗性qtlqfcr.sicau.2a紧密连锁的分子标记kasp97，所述分子标记kasp97含有小麦如seq id no:1所示序列第36bp处的多态性为a或g的核苷酸序列。

3、分子标记kasp97第36bp处的碱基为a时，小麦含有qtl qfcr.sicau.2a，对应小麦茎基腐病抗性强；分子标记kasp97第36bp处的碱基为g时，小麦不含qtl qfcr.sicau.2a，对应小麦茎基腐病抗性弱。

4、本发明中，所述小麦茎基腐病抗性qtl qfcr.sicau.2a位于小麦2a染色体上70.43-74.06mb之间的3.62mb区段内。该区间包含19个高置信度基因。

5、第二方面，本发明提供一套基于kasp技术开发的用于扩增所述分子标记的特异性引物组，所述引物组包括序列如seq id no:2-4所示的引物。

6、进一步地，seq id no:2和seq id no:3所示引物的5’端分别连有不同的荧光探针。

7、优选地，seq id no:2所示引物的5’端连有的荧光探针的核苷酸序列如seq idno:5所示，seq id no:3所示引物的5’端连有的荧光探针的核苷酸序列如seq id no:6所示，且seq id no:5和seq id no:6所示荧光探针的5’端分别连有不同的荧光基团，如fam、hex等。

8、第三方面，本发明提供含有所述引物组的检测试剂或试剂盒。

9、第四方面，本发明提供所述分子标记kasp97、所述引物组或含有所述引物组的检测试剂或试剂盒的以下任一应用：

10、(1)用于鉴定小麦茎基腐病抗性qtl qfcr.sicau.2a；

11、(2)用于筛选或鉴定高抗茎基腐病的小麦品种；

12、(3)用于小麦分子标记辅助育种；

13、(4)用于小麦种质资源改良。

14、第五方面，本发明提供一种鉴定小麦茎基腐病抗性qtl qfcr.sicau.2a的方法，以待测小麦的基因组dna为模板，利用所述引物组进行荧光定量pcr扩增，根据pcr扩增结果对待测小麦进行基因分型。

15、优选地，所述荧光定量pcr扩增的反应体系：2×kasp mastermix 5μl，kasp assaymix 0.14μl，模板dna 50ng，dnase/rnase-free去离子水加至总量为10μl；其中，所述kaspassay mix中含有seq id no:2-4所示的引物，三条引物的体积比为2:2:5，各引物浓度为100μm。

16、优选地，荧光定量pcr程序：95℃活化10min；95℃变性20s，65℃退火延伸60s，循环10次，每次退火延伸温度降低1℃；94℃变性20s，57℃退火延伸60s，循环36次；37℃60s，采集荧光信号。

17、前述的方法，含有小麦茎基腐病抗性qtl qfcr.sicau.2a的小麦品种出现与seqid no:2所示引物连接的荧光探针相同的荧光信号，而不含有小麦茎基腐病抗性qtlqfcr.sicau.2a的小麦品种出现与seq id no:3所示引物连接的荧光探针明显不同的荧光信号。

18、借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

19、本发明首次公开了地方小麦中定位的小麦茎基腐病抗性qtl qfcr.sicau.2a，位于小麦2a染色体上，显著提高了小麦茎基腐病抗病性。该qtl在小麦产量(提高小麦茎基腐病抗病性)育种中具有较高的利用价值。本发明进一步公开了基于荧光定量pcr平台精确检测小麦茎基腐病抗性qtl qfcr.sicau.2a的分子标记kasp97，位于小麦2a染色体上73.62mb位置，且为共显性标记，检测准确高效、扩增方便稳定。

20、本发明提供的分子标记kasp97与小麦茎基腐病抗性qtl qfcr.sicau.2a显著相关，呈现共分离标记特征，用于分子标记辅助选择的准确性高，提高适应不同环境的小麦特定茎基腐病抗病品种的选择鉴定效率，且成功率高。

21、利用本发明提供的方法能够加强小麦茎基腐病抗性预测的准确性，以便快速筛选出具有高抗小麦茎基腐病的qtl的小麦品种或品系用于育种，可以大大加快小麦高产品种的选育进程。