与IMP酶结合的抗体或其抗原结合片段及其应用的制作方法

本发明涉及单克隆抗体，尤其是涉及一种与imp酶结合的抗体或其抗原结合片段及其应用。

背景技术：

1、根据碳青霉烯酶活性位点结构与功能基团差异，可将其分为金属β-内酰胺酶(mbls或b类酶)和基于丝氨酸的碳青霉烯酶(a和d类酶)两类。imp(metallo-β-lactamasesresistant to imipenem)酶是首个在革兰氏阴性菌中检测到的获得性金属酶，可以水解青霉素类、碳青霉烯类以及头孢菌素类药物，但不能水解氨曲南。目前在全球范围已经有52种imp亚型在临床分离的革兰氏阴性菌中检测到，如假单胞菌属，不动杆菌属以及肠杆菌科细菌。

2、imp-1被认为是首个在革兰氏阴性菌中检测到的耐碳青霉烯类抗生素且由质粒编码的可移动性mbl。imp-1被发现于1988年在日本分离的铜绿假单胞菌中。此后，blaimp-1又在日本的粘质沙雷菌中被分离出来。目前已在超过15个国家或地区的革兰阴性菌中检测到blaimp-1。imp-2于1997年在意大利的一株鲍曼不动杆菌中首次被发现，随后也在日本的一株鲍曼不动杆菌和另外四种革兰氏阴性菌中检测到。在我国，imp-1、imp-4、imp-8和imp-9是常见的几类碳青霉烯酶。1998我国首次在香港报道检出imp型金属酶即是imp-4，随后不久，我国台湾从1株多药耐药肺炎克雷伯菌中分离到imp-8，2007年，我国在浙江省医院的一株阴沟肠杆菌中首次检出imp-1。

3、大多imp酶介导的氨基酸序列包含246个残基，imp-9、imp-11、imp-21的序列由245个残基构成。某些blaimp基因的等位基因是单点或双点突变体，例如imp-10与imp-1的不同主要是由单个碱基导致氨基酸的改变，imp-3与imp-1相比有2个氨基酸不同，其中196位氨基酸由丝氨酸(ser)残基转变为甘氨酸(gly)残基，导致imp-3不能水解青霉素、氨苄西林、头孢他啶和亚胺培南；还有某些等位基因彼此相对分散，imp-9和imp-18是相对最远的imp变体，有53个不同的氨基酸残基。imp酶具备典型的金属酶特征，即对青霉素类、头孢菌素类和碳青霉烯类具有不同程度的水解活性，但几乎不水解氨曲南，也不被β-内酰胺酶抑制剂抑制。

4、美国临床实验室标准化研究所(clinical and laboratory standardsinstitute,clsi)推荐改良霍奇试验作为肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶的表型确证试验。将大肠埃希菌(atcc25922)涂到mh琼脂平板上形成菌苔(0.5麦氏浊度1:10稀释)，然后将厄他培南或美罗培南纸片放在中心，将待测分离菌从纸片的边缘划线到平板的边缘，过夜培养，若出现苜蕾叶状抑菌环为碳青霉烯酶表型阳性。但用此方法进行imp酶检测，其敏感性和特异性还有待于进一步研究和评定。近年来，有学者根据部分碳青霉烯酶可被金属离子整合剂抑制的特点发展了1种可常规检测其耐药表型的方法，文献报道的主要有纸片扩散法、epi微量稀释法和浓度梯度(e-test法)，以肉眼观察结果，其敏感性和特异性会受到主观因素、待测菌的产酶能力等方面的影响，存在误读、漏读的可能，用时较长。carba np试验对大多数酶有很好的敏感性，cim是实验室常用于检测imp酶的方法，该方法具有较好的敏感性和特异性，但会受到细菌产酶能力的影响。

5、随着分子生物学的发展尤其是聚合酶链反应技术的问世，从基因水平进行检测和分析imp酶，不仅可以准确、快速检出imp酶基因，还可以对耐药基因进行定位，这有利于对产imp酶细菌的耐药机制以及流行病学研究，目前认为分子生物学技术是检测耐药基因型的金标准。但是随着imp酶新型别的不断发现，需要设计更多imp酶基因的特异性引物，仅利用当前设计的引物有可能对新型imp酶基因漏检，并且存在周期长、试验用具、设备等硬件要求高等诸多因素，导致该技术无法大范围地应用到基层医院，操作难度较高，步骤繁琐，部分试验对操作人员有专业要求，多由专业平台或实验室进行，部分试验要求操作人员进行专业课程的学习，单个检测成本较高。

6、单克隆抗体是由单一b细胞克隆产生的高度均一、仅针对特定抗原表位的抗体，通常采用杂交瘤细胞制备，基于细胞融合技术，将具有分泌特异性抗体能力的致敏b细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为b细胞杂交瘤，培养成细胞群后，可制备针对一种抗原表位的特异性抗体，即单克隆抗体。特异性抗体检测的目的首先是协助临床诊断，在某些疾病中亦是观察疗效及预后的一个指标，耐药性以及传染病流行病学调查中，特异性抗体的检测也具有特殊的、重要的意义。抗体免疫学检测具有以下优点：特异性高，使用特异的单克隆抗体，可用于单一细胞因子的检测；操作简便、快速，无需依赖细胞株，故不需维持培养，可操作性增加，容易推广和便于普查；影响因素相对较少且容易控制，重复性好，方法容易标准化。

7、cn112501131a公开了抗imp酶杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用，所述单克隆抗体具有纯度效价高、特异性强的特点，适合作为免疫诊断试剂用于体外诊断imp酶。但是上述单克隆抗体为鼠源单克隆抗体，尽管鼠源单克隆抗体属于使用最广泛的抗体，但仍然存在亲和力弱、特异性差的问题，因此，提供一种改进的imp酶抗体是目前市场需要的。

8、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的第一目的在于提供一种与imp酶结合的抗体或其抗原结合片段，以缓解现有技术中与imp酶结合的单克隆抗体效果不佳的技术问题。

2、本发明的第二目的在于提供一种与上述imp酶结合的抗体或其抗原结合片段相关的生物材料、试剂、试剂盒以及它们的应用，以改善现有的对imp的检测方法。

3、为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

4、根据本发明的一个方面，本发明提供了一种与imp酶结合的抗体或其抗原结合片段，包含轻链可变区和/或重链可变区；

5、所述轻链可变区具有由cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3组成的轻链cdr，所述cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3的氨基酸序列分别如seq_1、seq_2和seq_3所示；

6、或者，所述cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3的氨基酸序列分别如seq_11、seq_12和seq_13所示；

7、所述重链可变区具有由cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3组成的重链cdr，所述cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3的氨基酸序列分别如seq_4、seq_5和seq_6所示；

8、或者，所述cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3的氨基酸序列分别如seq_14、seq_15和seq_16所示。

9、根据本发明的一个方面，本发明提供了一种生物材料，生物材料包括核酸片段、载体或宿主细胞；

10、所述核酸片段选自(a1)或(a2)：(a1)、dna或rna，其编码权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段；(a2)、与(a1)中定义的核酸片段互补的核酸片段；所述载体包括所述核酸片段；所述宿主细胞被所述载体转化，或，所述宿主细胞的基因组中整合有所述核酸。

11、根据本发明的一个方面，本发明还提供了与imp酶结合的抗体或其抗原结合片段的生产方法，包括使用上述宿主细胞表达所述与imp酶结合的抗体或其抗原结合片段。

12、根据本发明的一个方面，本发明还提供了一种组合物，包括所述与ipm酶结合的抗体或其抗原结合片段和标记物；所述标记物与所述抗体或其抗原结合片段偶联；或，所述标记物与所述抗体或其抗原结合片段分别独立包装。

13、根据本发明的一个方面，本发明还提供了一种用于检测imp酶的试剂或试剂盒，包含上述抗体或其抗原结合片段，或上述组合物。

14、根据本发明的一个方面，本发明还提供了上述与imp酶结合的抗体或其抗原结合片段，生物材料、生产方法、组合物或用于检测imp酶的试剂或试剂盒在非诊断和治疗目的的检测imp酶或非诊断和治疗目的检测产imp酶的微生物中的应用。

15、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

16、本发明通过ncb序列比对，获得imp酶的保守序列，通过原核基因表达得到高纯度蛋白。将imp抗原蛋白免疫新西兰大耳白兔后获取分泌与imp结合的抗体的b细胞制备杂交瘤细胞，通过筛选获取能够分泌特异性好的抗体的杂交瘤细胞，经测序后得到分别如seq_1～3所示，或分别如seq_11～13所示的轻链cdr；以及分别如seq_4～6所示，或分别如seq_14～16所示的重链cdr。

17、本发明提供的与imp酶结合的抗体或其抗原结合片段的cdr区序列来源于兔，对imp酶的不同亚型均有特异性结合的能力，具有上述cdr序列的抗体或其抗原结合片段具有抗原识别位点多、特异性好、亲和力高等特点，在各方面均有较佳表现，从而适合作为免疫诊断试剂用于体外诊断imp酶或分泌imp酶的微生物，效价达到了1:1280000以上。尤其是上述轻链cdr和重链cdr在一些组合中构成的不同抗体之间可以良好的配对，可以应用于以形成抗体-抗原-抗体复合物为原理的免疫检测方法中，例如作为双抗夹心elisa中的一抗和二抗；或分别作为免疫层析检测卡中的标记抗体和包被于检测区的抗体等。

18、本发明提供的与imp结合的抗体或其抗原结合片段，以及与其相关的生物材料制备得到的试剂或试剂盒能够用于耐药菌株的早期分型，并指导临床用药，辅助临床感染控制和治疗。含有具有上述cdr序列的抗体或其抗原结合片段的试剂或试剂盒能够通过定性或半定量的检测从患者分离出来的细菌样本或者阳性血培养样本中的imp酶，来快速准确地判断患者细菌耐药的程度，快速检测细菌样本中是否存在imp酶，临床上可用于指导用药。