一种融合型新型腺相关病毒及其应用的制作方法

本发明涉及一种生物医药领域，特别是涉及一种融合型腺相关病毒及其应用，尤其涉及在肺部或者眼部中异源基因递送的应用。

背景技术：

1、当下基因相关的遗传性疾病全球患病人群高达3.5个亿，而其中约80％是直接由基因突变导致的。传统的药物治疗方法以大分子或小分子作用于蛋白靶点发挥药效，对于基因变异等遗传性疾病无法有效发挥治疗效果。而新兴的基因治疗方法，能将异源基因、小rna或基因编辑等工具导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，无需化学药物干预、放射治疗或手术治疗，就能达到治疗目的。

2、目前基因治疗的策略包括基因替代、基因修正、基因增强、基因抑制和基因失活，这些无一例外均需要基因转移。目前基因转移的方法有物理、化学和生物三大类，其中生物转移在人类细胞中应用最为广泛。生物法主要是指病毒介导的基因转移，以病毒为载体将异源基因通过重组技术与病毒重组，感染受体细胞以表达目的基因治疗疾病。近几十年来，病毒载体介导的基因疗法已被广泛应用于临床试验，以治疗心血管、肌肉、代谢、神经系统、血液、感官以及感染性疾病和癌症。

3、腺相关病毒(adeno-associated virus，aav)，属于微小病毒科，是目前发现一类结构最简单的单链dna缺陷型病毒,其复制过程通常需要辅助病毒参与。腺相关病毒作为异源基因导入的病毒载体，具有多方面的显著优势。其一，腺相关病毒是非致病性微生物，具有很高的生物安全性；其二，腺相关病毒不仅可以感染分裂细胞，还可以感染非分裂期细胞，其适用的宿主范围非常广；此外，腺相关病毒的基因组仅有5kb左右，便于重组改造和操作；另外，腺相关病毒的物理性质稳定，易于保存，56℃高温及ph3-9范围波动均不影响其感染活性。上述特点，促使腺相关病毒被广泛用为基因转移载体，成为了基因治疗研究的热点。美国fda在2017年宣布通过了spark therapeutics公司治疗遗传性视网膜营养不良(ird)的药物luxturna的申请许可，成为第一款获批的利用aav作为载体的基因治疗药物。这种基因疗法能够通过aav介导修复ird患者缺失的pre65基因，改善患者的感光能力和视野，达到改善功能视力的效果。该研究有力地证明了aavs在基因治疗领域的光明前景。

4、肺是基因治疗重要的靶器官，其中肺部容易产生最常见的遗传性疾病，如囊性纤维化(cf)和α1-抗胰蛋白酶缺乏症(α1at)，同时，肺癌也是人类最常见的死亡原因。迄今为止，已经批准了大约400个用于人类基因治疗的临床方案，其中大约10％的方案针对肺部疾病。目前从这些人体试验中获得的数据已经成功地证明了将基因转移到人类肺部是可能的，并且过度表达异源基因以治疗或控制肺部疾病的策略具有潜在的前景。迄今为止，通过病毒载体向肺部递送异源蛋白或者核酸的方式会有受限于目前的载体感染效率低，在低剂量条件下无法形成有效的感染，因此在治疗疾病的时候需要更高剂量的病毒，而高剂量的病毒具有更大的安全风险，因此，需要不断开发优化高效且特异的新型重组腺相关病毒，提高药效，降低安全隐患。

5、另外，全世界约有五百万人患有先天性视网膜营养不良，这通常会在幼年时期就导致失明。这些疾病往往是由特定的基因突变导致，目前已经发现了大约150个此类基因突变，这些突变会导致感光细胞或形成视网膜色素上皮的细胞功能丧失，从而导致失明。但目前基于aav病毒载体的眼病基因治疗，都需要将病毒载体直接注射到视网膜下，这种技术只有在拥有高水平专家和设备的专科医院才能进行，并且这种注射方式存在损坏脆弱的视网膜组织的风险。该方法的另一个缺点是由于aav病毒横向扩散能力较弱，每次注射只能靶向注射点附近的一小部分细胞。因此，需要开发出更好的适用于眼病基因治疗的病毒载体，可以通过微创给药就能更有效靶向视网膜感光细胞，以更安全更高效地治疗遗传性失明。

技术实现思路

1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种融合型腺相关病毒，用于解决目前aav病毒低剂量感染条件下肺部感染效率低，高剂量感染下安全风险高以及在视网膜等组织病毒递送困难的问题，用于基因治疗。本发明将改造的融合型新型腺相关病毒载体在体感染小鼠的肺近端和肺远端，能够介导目的基因在病毒低剂量感染下特异性在肺部细胞中表达。该新型腺相关病毒在肺部细胞的结构与功能分析、疾病模型建立和基因治疗等方面具有广泛的应用价值和市场前景。同时，该将病毒通过玻璃体注射到小鼠眼球中发现，该病毒载体具有较目前现有载体更优异的感染特性，在眼科细胞的结构与功能解析、疾病模型建立和基因治疗等方面同样具有广泛的应用价值和市场前景。

2、为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种融合型腺相关病毒aav-wm03衣壳蛋白，融合型腺相关病毒aav-wm03衣壳蛋白包含血清型aav1和aav6的融合肽段或其变体。

3、本发明还提供一种核酸，所述核酸编码如所述的融合型腺相关病毒aav-wm03衣壳蛋白。

4、本发明还提供一种构建体，所述构建含有所述的核酸。

5、本发明还提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含所诉的构建体或基因组中整合有异源的所述的核酸，或所述宿主细胞包含所述的融合型腺相关病毒aav-wm03。

6、本发明还提供一种融合型腺相关病毒aav-wm03，所述融合型腺相关病毒的衣壳结构包含任一种所述的融合型腺相关病毒aav-wm03衣壳蛋白。

7、此外，本发明还提供一种融合型腺相关病毒载体系统，包含包装质粒，辅助质粒。所述包装质粒包含所述的核酸、所述核酸的片段和所述的构建体。

8、本发明还提供一种融合型腺相关病毒，所述融合型腺相关病毒由所述融合型腺相关病毒载体系统经病毒包装获得。

9、本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合包含所述的融合型腺相关病毒以及药学上可接受的辅料。

10、最后，本发明还提供所述融合型腺相关病毒aav-wm03衣壳蛋白、核酸、构建体、融合型腺相关病毒、宿主细胞、融合型腺相关病毒载体系统、药物组合物或偶联物在制备治疗疾病的药物中的用途；优选地，在制备基因治疗疾病的药物中的用途；更优选地，在制备肺部疾病或者眼部疾病的基因治疗药物中的用途。

11、如上所述，本发明的融合型新型腺相关病毒，具有以下优点及有益效果：(1)提供了一种在aav病毒感染低剂量条件下可以高效感染肺部细胞的新型腺相关病毒aav-wm03；(2)提供了一种新型腺相关病毒载体aav-wm03，能够介导目的基因特异性地在成年小鼠视网膜rpe层中表达；(3)新型腺相关病毒载体aav-wm03介导目的基因表达比传统的转基因方法更灵活，安全性更高，应用更方便，成本更低；(4)新型特异性的腺相关病毒载体aav-wm03为开发精准治疗肺部及眼部相关疾病的基因疗法提供应用基础。

技术特征：

1.一种融合型腺相关病毒aav-wm03衣壳蛋白，其特征在于，融合型腺相关病毒aav-wm03衣壳蛋白包含血清型aav1和aav6的肽段的融合肽段或其变体。

2.如权利要求1所述的融合型腺相关病毒aav-wm03衣壳蛋白，其特征在于，所述融合肽段包含依次连接的第一肽段、第二肽段；所述第一肽段包含来自aav1的肽段，所述第二肽段包含来自aav6的肽段。

3.如权利要求1所述的融合型腺相关病毒aav-wm03衣壳蛋白，其特征在于，所述第一肽段包含seq id no.1所示的氨基酸片段，所诉第二肽段包含seq id no.2所示的氨基酸片段。

4.如权利要求1所述的融合型腺相关病毒aav-wm03衣壳蛋白，其特征在于，所述融合型腺相关病毒aav-wm03衣壳蛋白包括：

5.一种核酸，其特征在于，其所述核酸编码如权利要求1-4任一权利要求所述的融合型腺相关病毒aav-wm03衣壳蛋白。

6.一种构建体，其特征在于，所述构建体含有如权利要求5所述的核酸。

7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含如权利要求6所述的构建体或者基因组中整合有异源的如权利要求5所述的核酸，或所述宿主细胞包含如权利要求1-4任一项所述的融合型腺相关病毒aav-wm03衣壳蛋白。

8.一种融合型腺相关病毒aav-wm03，其特征在于，所述融合型腺相关病毒aav-wm03的衣壳结构含有如权利要求1-4任一项的融合型腺相关病毒aav-wm03衣壳蛋白。

9.如权利要求8所述的融合型腺相关病毒aav-wm03，其特征在于，所述融合型腺相关病毒还包括编码目的产物的异源核苷酸序列；优选地，所述目的产物为核酸或者蛋白质；进一步地，所述核酸选自小向导rna、干扰rna。

10.一种细胞，其特征在于，所述细胞为使用如权利要求8或9所述的融合型腺相关病毒aav-wm03转化得到。

11.一种融合型腺相关病毒载体系统，其特征在于，所述融合型腺相关病毒载体系统包含包装质粒，所述包装质粒中包含权利要求5所述的核酸。

12.如权利要求11所述的融合型腺相关病毒载体系统，其特征在于，所述包装质粒中还包含腺相关病毒的rep基因片段。

13.根据权利要求11所述的融合型腺相关病毒载体系统，其特征在于，所述腺相关病毒载体系统还包括表达质粒，所述表达质粒包含负责编码目的产物的异源核苷酸；优选地，所述目的产物为核酸或者蛋白质；进一步地，所述核酸选自小向导rna、干扰rna。

14.根据权利要求11-13任一项所述的融合型腺相关病毒载体系统，其特征在于，所述腺相关病毒载体系统还包括辅助病毒质粒或辅助病毒，所述融合型腺相关病毒载体系统还包括宿主细胞。

15.一种药物组合物或偶联物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求8或9任一项所述的融合型腺相关病毒aav-wm03以及药学上可接受的辅料；所述偶联物包含如权利要求8或9任一项所述的融合型腺相关病毒aav-wm03以及其上连接的生物活性多肽。

16.根据权利要求15所述的药物组合物或偶联物，其特征在于，所述药物组合物或者偶联物剂型为注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、滴眼剂或滴鼻剂中的一种或多种。

17.如权利要求1～4任一项所述的融合型腺相关病毒aav-wm03衣壳蛋白、或如权利要求5所述的核酸、或如权利要求6所述的构建体、如权利要求8或9所述的融合型腺相关病毒aav-wm03或如权利要求7所述的宿主细胞或权利要求10所述的细胞、权利要求11-13任一项所述的融合型腺相关病毒载体系统、或如权利要求15或16所述的药物组合物或偶联物在制备预防或治疗疾病的药物中的用途。

18.如权利要求17所述的用途，其特征在于，包括以下至少一项：

19.如权利要求18所述的用途，其特征在于，包括以下至少一项：

技术总结
本发明涉及生物医药领域，公开了一种融合型腺相关病毒及其在肺部和眼部中基因递送的作用。所述融合型腺相关病毒包含血清型AAV1和AAV6的肽段融合形成的融合肽段或其变体，在低剂量的用量下高效感染肺部，所述腺相关病毒也能高效地感染视网膜色素上皮(RPE)层，用于向眼部的基因递送。所述融合型腺相关病毒作为安全的载体，在治疗肺部或者眼部疾病中具有广泛的应用前景。

技术研发人员：钟桂生,储岑凤
受保护的技术使用者：上海玮美基因科技有限责任公司
技术研发日：
技术公布日：2024/4/8