一种工程化细胞外囊泡的构建及其应用的制作方法

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种工程化细胞外囊泡、其制备方法及应用。

背景技术：

1、细胞外囊泡(extracellular vesicle,ev)是由细胞分泌的，能够被受体细胞摄取的膜性囊泡小体，直径大约为30-1000nm。ev作为蛋白质、rna、脂质等生物大分子在细胞间转运的载体，是细胞与细胞间通讯的重要媒介。因ev广泛存在于人体的各种体液中，既可以作为液体活检的样本来源，也被认为是一种天然驯化的药物载体。

2、ev可作为药物载体携带和运输药物，例如具有治疗效果的多肽和蛋白。为了让ev携带的目的蛋白能够发挥效果，需要确保目的蛋白在ev内的量足够高。然而，在细胞中异源表达的非外泌体目的蛋白并不会被主动分拣到细胞外囊泡中。

3、根据已有的报道，目前有约20种蛋白被报道可用于目的蛋白在ev中的装载(theranostics,2019；9(4):1015-1028)。wo2013084000a2、wo2014168548a2、wo2018015535a1、wo2019040920a1等专利申请也描述了将蛋白装载到ev的方法。

技术实现思路

1、本技术的发明人在研究中意外发现，从蛋白家族具有将与之融合的目的蛋白携带并富集至细胞外囊泡的作用。基于以上发现，发明人完成本发明。

2、在第一个方面，本发明提供一种包含融合蛋白的工程化细胞外囊泡，其中，所述融合蛋白包含融合伴侣(fusion partner)，所述融合伴侣为定位于细胞外囊泡膜上的蛋白或其变体，优选地，所述融合蛋白还包含目的蛋白(target protein)。

3、本文所使用的术语“细胞外囊泡(extracellular vesicles,evs)”是指是指从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体，直径从40nm到1000nm不等，主要形式为微囊泡(microvesicles,mvs)和外泌体(exosomes,exs)。细胞外囊泡广泛存在于细胞培养上清以及各种体液(血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁)中，携带有细胞来源相关的多种蛋白质、脂类、dna、mrna、mirna等，参与细胞间通讯、细胞迁移、血管新生和免疫调节等过程。术语“工程化细胞外囊泡”是指人工合成的细胞外囊泡，或经过人为干预后细胞产生的细胞外囊泡，或基因工程改造后细胞产生的细胞外囊泡。术语“未工程化的细胞外囊泡”是指天然的、未经改造的细胞在正常条件下(例如生理条件)分泌的细胞外囊泡。

4、本文所指蛋白包括其变体，蛋白的“变体”是指其氨基酸序列与天然存在的相应蛋白(有时也称野生型，wild type)的氨基酸序列不同但具有与野生型蛋白相同或相似功能的蛋白。蛋白的变体可由天然存在的蛋白质经氨基酸缺失、添加和/或替换而来，所述变体还可以是天然蛋白的截短形式(有时也称为其片段)。

5、本文所使用的术语“融合伴侣”是指与目的蛋白融合的一段多肽，所述融合伴侣可定位于细胞外囊泡的膜上，同时将与其融合的目的蛋白携带至细胞外囊泡。

6、在本发明的一些实施方案中，其中所述融合伴侣具有如下特征：1)为i型跨膜蛋白；2)所述跨膜蛋白的跨膜区和邻接胞内区包含α螺旋，所述α螺旋的长度为20-200个氨基酸，优选为30-90个氨基酸，更优选为40-80个氨基酸，所述跨膜区的一部分或全部位于所述α螺旋；和3)胞外区包含1至5个ipt结构域。

7、本文所使用的术语“i型跨膜蛋白”是指单次跨膜蛋白，其n端位于膜外，c端位于膜内。“跨膜区和邻接胞内区”中的“邻接胞内区”是指与所述跨膜区紧挨着的胞内区段。本文所使用的术语“α螺旋”(alpha helix)可以指一个α螺旋，也可以指多个α螺旋，例如多个α螺旋形成的coiled coil结构域。

8、本文所使用的术语“ipt(immunoglobulin-like fold,plexins,transcriptionfactors)结构域”，也称tig(transcription factor immunoglobin)结构域，是指具有免疫球蛋白样折叠的结构域。

9、在一些实施方案中，所述融合伴侣选自丛蛋白家族成员，例如plxna、plxnb、plxnc和plxnd家族成员，例如plxna1、plxna2、plxna3、plxna4、plxnb1、plxnb2、plxnc1和plxnd1。

10、目前发现的丛蛋白家族成员包括plxna1(plexin a1)、plxna2、plxna3、plxna4、plxnb1、plxnb2、plxnc1和plxnd1等。丛蛋白是信号素(semaphorin)的跨膜蛋白受体，这类分子参与许多与细胞增殖、粘附以及基底膜、细胞运动和侵袭能力相关的细胞活动。这类蛋白在脑组织、内分泌系统、消化道系统、呼吸系统，以及骨髓和淋巴系统等都有表达。

11、以plxna1为例，plxna1能够通过直接结合跨膜信号素6d，或通过神经纤毛蛋白-1和-2间接结合3类分泌的信号素，介导导致细胞迁移和轴突排斥的细胞骨架重塑。plxna1蛋白包含多个结构域，如图1a所示。全长plxna1具有激活(图1b)和非激活(图1c)两种状态。由于全长plxna1具有生物学活性，并不适合作为携带目的蛋白的融合伴侣。发明人意外发现，将plxna1的胞外区和/或胞内区截掉，与目的蛋白融合后，可将目的蛋白携带至细胞外囊泡起到富集作用。

12、特别地，所述融合伴侣选自plxna1和plxna2或其片段。所述片段可以是包含选自seq id no:2-6的片段，特别地，所述融合伴侣的序列选自seq id no:2-6。

13、在一些实施方案中，所述融合蛋白是由外源序列表达的工程化跨膜蛋白，所述跨膜蛋白包含式(i)所示的片段：

14、xaa1…xaan xaa(n+1)xaa(n+2)xaa(n+3)xaa(n+4)(i)，(seq id no:15)

15、优选地，所述式(i)片段位于跨膜区上游；

16、其中，xaa1选自s、t、c、n、y和q；xaa2至xaan为任意氨基酸，n为1至20的整数；xaa(n+1)、xaa(n+2)和xaa(n+4)各自独立地选自l、i、g、a和v；xaa(n+3)选自t、s、c、n、y和q。

17、在一些实施方案中，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选为1、2、3、4或5。在另一些实施方案中，xaa1选自s、t、c和n；xaa(n+1)、xaa(n+2)和xaa(n+4)各自独立地选自l和i；xaa(n+3)选自t、s、c和n。在又一些实施方案中，xaa1为s，xaa(n+1)、xaa(n+2)和xaa(n+4)为l，xaa(n+3)为t。在一个具体的实施方案中，式(i)所示的片段为sdslltl(seq id no:14)。

18、在一些实施方案中，所述融合蛋白包含选自如下的序列：seq id no:2-6。

19、本文所使用的术语“外源序列”是指该序列不是细胞内天然存在的序列，而是人工构建的序列。本文中的氨基酸可以是天然氨基酸或者非天然氨基酸，用本领域公知的三字母或单字母表示，例如：丙氨酸(ala或a)、精氨酸(arg或r)、天冬酰胺(asn或n)、天冬氨酸(asp或d)、半胱氨酸(cys或c)、谷氨酰胺(gln或q)、谷氨酸(glu或e)、甘氨酸(gly或g)、组氨酸(his或h)、异亮氨酸(ile或i)、亮氨酸(leu或l)、赖氨酸(lys或k)、甲硫氨酸(met或m)、苯丙氨酸(phe或f)、脯氨酸(pro或p)、丝氨酸(ser或s)、苏氨酸(thr或t)、色氨酸(trp或w)、酪氨酸(tyr或y)和缬氨酸(val或v)。“相似氨基酸”是指结构、性质相近的一些氨基酸，这些氨基酸之间互相替换时往往对蛋白的结构和性质影响不大，可互换使用。

20、在一些实施方案中，所述目的蛋白可以位于所述融合伴侣的上游，也可以位于融合伴侣的下游。本文所指蛋白的“上游”是指多肽的n末端或者靠近n末端的部分，蛋白的“下游”是指多肽的c末端或者靠近c末端的部分。根据实际需要，目的蛋白可被包含在细胞外囊泡内部，也可以被展示在细胞外囊泡的外表面。

21、在本发明的一些实施方案中，所述目的蛋白是治疗性肽、靶向肽、亲和标签或连接治疗化合物的接头。

22、本文所使用的术语“治疗性肽”是指具有治疗活性的蛋白或其变体，包括但不限于抗体或其抗原结合片段、受体、配体、细胞因子、激素，等等。在本发明的一些实施方案中，所述治疗性肽可以是人白细胞介素家族成员(例如，il-2,il-7,il-10,il-11,il-12,il-15和il-23)，肿瘤坏死因子家族成员(例如，tnf,lta,ltb,faslg,tnfsf8,tnfsf9,tnfsf10,tnfsf11,tnfsf12,tnfsf13,tnfsf14,tnfsf15,tnfsf18和eda)，干扰素(inf-α,inf-β和inf-γ)，t cell engager(例如，4-1bb,ox40,cd28,cd40,cd40l,cd47,cd27,cd70,cd80,cd86,gitrl,icosl,cd155,cd112,tim-3,btla)，和其他细胞因子(例如，g-csf,epo,tpo,gm-csf,egf,bfgf,fviia,atⅲ,tnk,α-glucosidase,bmp-2,hirudin)。

23、本文所使用的术语“靶向肽”是指能够被特定细胞识别和结合的多肽，也就是说，能够靶向特定细胞的多肽。在本发明的一些实施方案中，所述靶向肽是靶向细胞的多肽，所述靶向肽可以是抗体或其抗原结合片段、细胞表面受体或配体。

24、本文所使用的术语“亲和标签”是指能够与相应亲和剂结合的短的多肽，常用于蛋白的分离和纯化。在本发明的一些实施方案中，所述亲和标签可以是his标签、谷胱甘肽巯基转移酶(gst)、s-肽、zz结构域、白蛋白结合结构域(abd)、ha、myc、flagtm、麦芽糖结合蛋白(mbp)、钙调蛋白结合肽(cbp)、sumo、链球菌蛋白g(protein g)和金葡菌蛋白a(proteina)。

25、本文所使用的术语“连接治疗化合物的接头”是指将治疗化合物连接到融合伴侣上的物质。

26、在本发明的一些实施方案中，所述细胞外囊泡包含两种或更多种融合蛋白，例如所述两种或更多种融合蛋白各自独立地包含不同的目的蛋白。不同的目的蛋白可以与相同的融合伴侣形成融合蛋白，也可以与不同的融合伴侣形成融合蛋白，不同的融合蛋白可被携带到同一细胞外囊泡中。

27、本文所使用的术语“治疗剂”是指具有治疗作用的物质，可以是核苷酸、氨基酸、脂质、碳水化合物、小分子、抗体、酶、配体、受体、多肽等等。在本发明的一些实施方案中，所述细胞外囊泡内包含治疗剂，所述治疗剂可以是治疗性肽、多核苷酸和小分子化合物。

28、在第二个方面，本发明提供一种药物组合物，其包含第一个方面所述的细胞外囊泡和药学上可接受的载体。

29、本文所使用的术语“药学上可接受的载体”可选自：水、缓冲水溶液、等渗盐溶液如pbs(磷酸盐缓冲液)、葡萄糖、甘露醇、右旋葡萄糖、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸镁、0.3％甘油、透明质酸、乙醇或聚亚烷基二醇如聚丙二醇、甘油三酯等。所用可药用载体的类型尤其依赖于根据本发明的组合物是否配制为用于经口、鼻、皮内、皮下、肌内或静脉施用。根据本发明的组合物可包含润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色物质、矫味物质和/或芳香物质等作为添加剂。

30、在第三个方面，本发明提供一种工程化细胞，其用于生产第一个方面所述的细胞外囊泡，所述细胞包含编码所述融合蛋白的多核苷酸。

31、在本发明的一些实施方案中，所述编码融合蛋白的多核苷酸以游离的方式存在于所述细胞中，例如通过瞬时转染导入细胞。在本发明的另一些实施方案中，所述多核苷酸被整合入所述细胞的基因组中。在本发明的另一些实施方案中，所述多核苷酸为一种、两种或更多种，编码一种、两种或更多种融合蛋白。

32、在第四个方面，本发明提供一种治疗疾病的方法，其包括向有此需要的对象施用第一个方面所述的细胞外囊泡、第二个方面所述的药物组合物或第三个方面所述的细胞。

33、本文所使用的术语“对象”是指哺乳动物，如人类，但也可以是其它动物，如野生动物(如苍鹭、鹳、鹤等)，家畜(如鸭、鹅等)或实验动物(如猩猩、猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠、土拨鼠、地松鼠等)。

34、可通过本领域已知的多种方法施用本发明的组合物。本领域技术人员将理解，施用途径和/或模式将依赖希望的结果而变化。为了通过特定施用途径施用本发明的化合物，可能需要用避免其失活的材料覆盖化合物，或与所述材料共同施用化合物。例如，可在合适的载体中，例如脂质体或稀释剂中对受试者施用化合物。可药用的稀释剂包括盐溶液和水性缓冲液。药物载体包括无菌水溶液或分散液和无菌粉末，用于临时制备无菌的可注射的溶液或分散液。用于药物活性物质的这样的介质和试剂的用途是本领域已知的。

35、本发明还提供第一个方面所述的细胞外囊泡、第二个方面所述的药物组合物或第三个方面所述的细胞在制备用于治疗疾病的药物中的用途。

36、在第五个方面，本发明提供一种制备第一个方面所述细胞外囊泡的方法，其包括

37、1)提供细胞，其包含编码所述融合蛋白的多核苷酸，

38、2)在适合表达所述融合蛋白的条件下培养所述细胞，和

39、2)分离所述细胞外囊泡。

40、在本发明的一些实施方案中，所述导入是瞬时的，例如通过脂质体转染、电转等方式将编码所述融合蛋白的多核苷酸导入宿主细胞。在另一些实施方案中，所述导入是稳定的，例如通过基因编辑技术将编码所述融合蛋白的多核苷酸插入宿主细胞的基因组中，使宿主细胞稳定地表达工程化的细胞外囊泡。

41、本领域技术人员熟知的可用于蛋白表达的细胞均可用于本发明，优选为真核细胞，例如expi293、hek293和hek293f。

42、在第六个方面，本发明提供一种向靶细胞递送目的蛋白的方法，其包括

43、1)提供第一个方面所述的细胞外囊泡，其中所述融合蛋白包含需递送的目的蛋白，和

44、2)将所述细胞外囊泡与所述靶细胞接触。

45、在第七个方面，本发明提供一种分离第一个方面所述细胞外囊泡的方法，其包括

46、1)在细胞中表达所述融合蛋白，所述融合蛋白包含亲和标签，

47、2)使所述细胞外囊泡与能够结合所述亲和标签的结合剂接触，和

48、3)基于所述亲和标签与所述结合剂的结合来分离所述细胞外囊泡。

49、本文所使用的术语“结合剂”是指能够与亲和标签结合的物质，结合剂与亲和标签以较高亲和力结合，有助于通过结合剂分离与亲和标签连接的融合蛋白。

50、在第八个方面，本发明提供一种融合蛋白，所述融合蛋白是由外源序列表达的工程化跨膜蛋白，所述跨膜蛋白包含式(i)所示的片段：

51、xaa1…xaan xaa(n+1)xaa(n+2)xaa(n+3)xaa(n+4)(i)，(seq id no:15)

52、优选地，所述式(i)片段位于跨膜区上游；

53、其中，xaa1选自s、t、c、n、y和q；xaa2至xaan为任意氨基酸，n为1至20的整数；xaa(n+1)、xaa(n+2)和xaa(n+4)各自独立地选自l、i、g、a和v；xaa(n+3)选自t、s、c、n、y和q。

54、在一些实施方案中，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选为1、2、3、4或5。在另一些实施方案中，xaa1选自s、t、c和n；xaa(n+1)、xaa(n+2)和xaa(n+4)各自独立地选自l和i；xaa(n+3)选自t、s、c和n。在又一些实施方案中，xaa1为s，xaa(n+1)、xaa(n+2)和xaa(n+4)为l，xaa(n+3)为t。在一个具体的实施方案中，式(i)所示的片段为sdslltl(seq id no:14)。

55、在本发明的一些实施方案中，其中所述融合蛋白可以是包含选自seq id no:2-6的片段。

56、在第九个方面，本发明提供所述融合蛋白在制备工程化细胞外囊泡中的应用。