环状RNA联合作为肺腺癌分子标志物的应用

本发明属于生物医药领域，尤其涉及一种环状rna联合作为肺腺癌分子标志物的应用。

背景技术：

1、肺腺癌是非小细胞肺癌中最常见的一种亚型，约占40％。尽管近年来靶向治疗和免疫治疗等新兴治疗手段发展迅速，但肺癌患者的临床预后依然较差，多数诊断为转移性晚期的nsclc患者5年生存率仍然较低，仅为17％左右。主要原因是缺乏有效的早期筛查和诊断的方法。

2、目前公认的低剂量计算机断层扫描(low-dosecomputed tomography，ldct)筛查肺癌时，存在假阳性率较高和放射性损伤的缺点。临床上经常应用的各种血清肿瘤标志物，如癌胚抗原(carcinembryonicantigen，cea)、血清唾液酸(serum sialic acid，sa)、鳞状上皮细胞癌抗(quamous cell crcinioma atigen，scc)和细胞角蛋白片段19(eytokeratin19fragment)等灵敏性和特异性均不高。

3、circ rna是一类共价闭合环状结构的非编码rna，具有分布广泛、种类繁多、有多种调节功能的特点。近年来，液体活检技术由于其创伤小、可反复取材，广泛应用于疾病的早期筛查。体液中circ rna由于具有良好的稳定性，成为肿瘤诊断的候选标志物。song等人在膀胱癌患者尿液中发现hsa_circ_0137439明显上调，并通过hsa_ciec_0137439/mir-142-5p/mtdh轴促进肿瘤增殖和迁移，与肿瘤分期、淋巴结转移及肌肉浸润有关，可能成为膀胱癌诊断和预后评估的一种潜在的的生物标志物。zhao等人同样在口腔癌患者唾液内检测到高表达的hsa_circ_0001874和hsa_circ_0001971，联合应用的roc曲线下面积为0.922，术后唾液中两种circ rna的表达水平均明显低于术前，可作为口腔鳞癌诊断的生物标志物。hsa_circ rna_0056616在血浆中显著上调，其auc值为0.812，且其表达水平与肺癌患者的肿瘤大小淋巴结转移呈明显相关，提示hsa_circ rna_0056616作为肺癌的诊断标志物具有潜在的应用价值。但由于血浆中circ rna丰度较低，使用传统qrt-pcr技术检测血浆circ rna会出现假阴性的结果。而rt-ddpcr因其灵敏度高、可做到绝对定量检测，是检测血浆中circ rna的更佳选择。guo等人用rt-ddpcr分析了胃癌患者与健康人血浆中circ rna的表达情况，发现血浆hsa_circ_0001017和hsa_circ_0061276在胃癌患者血浆中表达明显降低，且两种circ rna联合诊断效能评估，auc值为0.966，可以作为胃癌有效的诊断标志物。但目前肺腺癌中rt-ddpcr检测外周血circ rna用于早期诊断的研究未见报道。

技术实现思路

1、为克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种环状rna联合作为肺腺癌分子标志物的应用。

2、本发明的再一目的再一提供上述环状rna联合作为肺腺癌分子标志物在筛选肺腺癌药物中的应用。

3、本发明的另一目的在于提供上述环状rna联合在制备抗肿瘤药物中的应用。

4、本发明是这样实现的，环状rna联合在制备用于对肺腺癌进行诊断或预后的工具中的应用，该环状rna组合由circ lzic和circ cep350构成。

5、利用ucsc和circbase数据库分析两个circ rna分子的相关信息：circ lzic(hsa_circ_0000014)来自1号染色体的lzic基因，序列为：chr1:9，991，948-9，994，918，由lzic的第5号、6号、7号3个外显子构成；circ cep350(hsa_circ_0003942)来自1号染色体的cep350基因，序列为chr1:179，972，308-179，975，702，由cep350基因的第7号和第8号2个外显子构成。

6、本发明中使用的“筛查、诊断或预后”中，筛查为对肺腺癌发生早期的筛查以及对肺腺癌病变的预判，诊断为判断受试者是否发生肺腺癌，预后为判断受试者是否存在肺腺癌复发的可能性或者判断受试者已经复发。

7、优选地，所述试剂盒、试纸芯片或高通量测序平台包括用于检测circ lzic和circcep350的引物或探针。

8、具体地，所述芯片包括固相载体，以及固定在所述固相载体上的用于检测circlzic和circ cep350的引物或探针；所述的固相载体可采用基于芯片领域的各种常规材料，包括但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。

9、所述高通量测序平台包括用于用于检测circ lzic和circ cep350的引物或探针；

10、所述试剂盒和试纸，包括用于检测circ lzic和circ cep350的引物或探针。

11、更具体地，所述circ lzic的引物为：

12、circ lzic f：5’-gcaggtgctatactcagcca-3’；

13、circ lzic r：5’-tccatctctgctaaccttgtcc-3’；

14、所述circ cep350的引物为：

15、circ cep350 f：5’-gcacagttatcaagtacagaatgc-3’；

16、circ cep350 r：5’-cacactttcccatcaggtgtt-3’；

17、所述探针为在引物的5'修饰为fam基团，3'修饰为tamra基团。

18、本发明进一步公开了环状rna联合作为肺腺癌分子标志物在筛选肺腺癌药物中的应用，该环状rna组合由circ lzic和circ cep350构成。

19、在得知了全面所述的circ lzic和circ cep350与肺腺癌的密切相关性后，可以基于该特征来筛选促进或者抑制circ lzic和circ cep350表达的物质；进而可从所述的物质中找到对于治疗结肺腺癌真正有用的药物。因此，本发明还提供了一种筛选治疗肺腺癌的潜在物质的方法，所述的方法包括：用候选物质处理结肺腺癌相关细胞体系，若所述候选物质可促进或抑制前面circ lzic和circ cep350表达或活性，则表明该候选物质是治疗结肺腺癌的潜在物质。

20、具体地，所述细胞体系可以是亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等；优选地，对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物实验，以进一步选择和确定对于治疗肺腺癌真正有用的物质。

21、本发明进一步公开了环状rna联合在制备抗肿瘤药物中的应用，该环状rna组合由circ lzic和circ cep350构成，所述肿瘤为肺腺癌。

22、优选地，所述抗肿瘤药物为抑制肺腺癌细胞增殖的药物。

23、优选地，所述的抗肿瘤药物包括有效剂量的circ lzic和circ cep350的抑制剂；所述抑制剂为蛋白、寡核苷酸、小分子化合物、慢病毒液和/或表达质粒。

24、所述抑制剂能够抑制circ lzic和circ cep350的表达、或能够抑制circ lzic和circ cep350的活性、或能够抑制circ lzic和circ cep350的有效作用时间、或能抑制circlzic和circ cep350的稳定性。

25、具体地，根据circ lzic和circ cep350下游mirna和靶基因预测，发现circ lzic分子功能(mf)主要富集在：细胞外基质结构成分、mrna 3'-utr结合、β-连环蛋白结合、血小板衍生生长因子结合；circ lzic下游靶基因生物过程(bp)主要富集在：通过血浆膜粘附分子的细胞间粘附、质膜粘附分子粘附同质细胞、囊泡定位、突触小泡循环等；circ lzic细胞组成(cc)主要为：胶原三聚体、细胞外基质组分、带状胶原纤维等。而circ cep350分子功能(mf)主要富集在：rna聚合酶ii近端启动子序列-特异性dna结合、近端启动子序列特异性dna结合、泛素样蛋白连接酶结合等；circ cep350下游靶基因生物过程(bp)主要富集在：膜通透性的调节、线粒体膜通透性的正调控、受体回收、凋亡过程中线粒体的调控；circcep350细胞组成(cc)主要为：胞外囊泡、细胞间紧密连接、顶端连接复合体、轴突部分。

26、本发明继续应用david网站对目标circ rna及下游mirna和靶基因进行kegg分析，发现circ lzic参与的通路，富集基因数最多的依次为relaxin信号通路、多巴胺能突触、神经营养蛋白信号通路等)；而circ cep350参与的主要通路依次为调节多能干细胞的信号通路(signaling pathways regulating pluripotency ofstem cells)、hippo信号通路、大肠癌、胰腺癌、轴突引导等。

27、因此，根据预测和检验到的结果，所述抑制剂的靶标不限于circ lzic和circcep350本身，还包括circ lzic和circ cep350的上下游，例如：编码circ lzic和circcep350的基因组序列，circ lzic和circ cep350的靶基因、调控circ lzic和circ cep350的蛋白或基因等。

28、从药物本质上来说，优选地，所述抑制剂包括蛋白、寡核苷酸、小分子化合物、寡核苷酸表达载体、慢病毒液、表达质粒和/或小干扰rna。

29、从药物形式上来说，优选地，所述抗肿瘤药物包括药物学上可以接受的载体；所述载体为稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。

30、其中，所述抗肿瘤药物可以单独施用，或者与其他能够治疗肺腺癌的药物进行组合施用；受试者可以是人类或者其他哺乳动物；更具体的，受试者是器官、组织、细胞。所述抗肿瘤药物可以离体施用，具体为：将环状rna的表达载体在体外导入或转染人体自身或异体细胞(或异种细胞)，经体外细胞扩增后，输回人体。所述的抗肿瘤药物可以体内施用，具体为：将环状rna的表达载体直接导入体内；所述表达载体可以是病毒型或非病毒型，甚至是裸dna或rna。

31、本发明使用的“有效剂量”是指可对人体和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述circ lzic和circ cep350有效剂量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选地有效剂量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述circ lzic和circcep350抑制剂的药代动力学参数例数生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病严重程度、患者的体重、患者的免疫状态、给药途径等。

32、本发明中分析环状rna表达谱的方式包括但不限于以下几种：一步法反转录微滴式数字聚合酶链式反应方法(rt-ddpcr)、反转录聚合酶链式反应方法(rt-pct)、实时荧光定量聚合酶链式反应方法(real-time pcr)、原位杂交方法(in situ hybridization)、northern印迹杂交方法(northernblotting)、核糖核酸酶保护测定方法(rnaseprotection assay)、solexa测序技术(solexasequencingtechnology)和生物芯片。在本发明的具体实施方式中，采用了一步法反转录微滴式数字聚合酶链式反应方法(rt-ddpcr)。

33、本发明中使用的“环状rna”与“circular rna”、“circ rna”通用。

34、本发明中使用的“治疗肺腺癌”包括疾病的好转、缓解、治愈。

35、相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：

36、(1)本发明首次发现了circ lzic和circ cep350作为联合指标后与肺腺癌存在特殊相关性，通过检测受试者circ lzic和circ cep350的表达，可以判断受试者是否患有肺腺癌、或判断受试者是否存在患有肺腺癌的风险，从而可应用于肺腺癌药物的筛选；

37、(2)本发明的circ lzic和circ cep350联合还可以作为筛选肺腺癌诊治的有效靶点，将其制成诊断试剂盒、试纸、芯片等诊断工具，可用于肺腺癌的早期筛查、诊断；

38、(3)本发明通过预测证明circ lzic和circ cep350联合可以抑制肺腺癌增殖的生物学过程，因此认为circ lzic和circ cep350联合是治疗肺腺癌的药物靶标。作为一种新的肺腺癌相关性诊治分子标志物，相比传统的检测手段，环状诊断更具及时性、更具特异性、更具灵敏性，能够实现肺腺癌的早期诊断，从而降低肺腺癌的死亡率。该分子标志物为临床医师制定个性化治疗方案提供理论基础，可用于临床消化道肿瘤的早期筛查、诊断及治疗，在临床上具有广泛的应用前景。