包含干细胞外泌体的药物组合物及其制备方法与流程

本发明涉及生物领域，具体的涉及一种包含干细胞外泌体的药物组合物及其制备方法。

背景技术：

1、外泌体(exosomes)是细胞分泌到胞外的一种囊泡(extracellular vesicles，evs)，其大小为30-150nm，具有双层膜结构，外泌体中携带有母细胞的多种蛋白质、脂类、dna和rna等重要信息，参与细胞间的分子传递。外泌体广泛存在于细胞培养上清以及各种体液中，包括血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁等，同时也存在于组织样本中，如脑组织、肌肉组织、脂肪组织等。

2、外泌体的内容物主要取决于其细胞来源，内容繁多且成分复杂，通常包括一些生物活性物质，已知存在不同组织及细胞的外泌体内含有194种脂类，4563种蛋白质，1639种mrnas和764种micrornas。其中核内体分类转运复合物和四分子交联体家族成员(如cd9、cd63、cd81、cd82、cdl51)参与外泌体形成过程的分类转运。而且，有研究发现外泌体既可以表达一些mhci类分子，hsp70、hsp90、her2/neu和manl，同时还可以招募多种来自于非浆膜的细胞蛋白，包括mhc分跨膜四蛋白、黏附分子和金属蛋白酶。外泌体介导细胞间的蛋白质、脂质、核酸的转运，调节受体细胞的多种生物活动，如影响基因表达。研究发现乳腺癌来源的外泌体可以调节巨噬细胞的促炎反应。在免疫系统中，一方面，树突状细胞或者肿瘤细胞的外泌体可以诱导抗肿瘤活动；另一方面，又可诱导生理状态下的免疫耐受，比如妊娠，以及在肿瘤的进展中的免疫耐受。外泌体与靶细胞膜融合后，一方面能促进供体细胞向受体细胞转运细胞表面的分子和受体；另一方面外泌体上表达的配体可以干扰细胞表面受体一配体结合，甚至可以重组受体细胞，导致受体细胞的转变。近年来研究发现外泌体在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用，比如肿瘤的形成、进展和转移、免疫调节、免疫逃逸、血管生成、调节肿瘤转移的微环境、促进上皮-间质转化(emt)。

3、外泌体也可以作为疾病治疗和药物运输的工具。基于rna的治疗药物通过递送小干扰rna(smallinterferingrna，sirna)沉默病理基因或通过将外源mrna递送至细胞来表达治疗性蛋白质，在治疗各种疾病方面具有巨大潜力。在mrna/sirna输送方面，传统载体如脂质体和纳米颗粒具有无传染性，材料来源广泛，易于大量制备等优点，有着病毒载体不可替代的优势，但是它们输送效率较低、难以通过生物屏障到达病灶部位，并且易引发免疫反应被机体快速清除掉。与传统载体不同的是，一方面，外泌体包含可增强内吞作用的跨膜蛋白和膜锚定蛋白，从而促进其内部携带物质的传递；另一方面，外泌体也含有一些抑制吞噬作用的跨膜蛋白而不被循环系统快速清除，如外泌体蛋白cd47，它是一种广泛表达于细胞表面的整合素相关蛋白，可向巨噬细胞发出一种“不要吃我”的信号，保护细胞免受吞噬。学者开发了一种生物相容性肿瘤细胞-外泌体护套psinps，作为靶向癌症化学疗法的药物载体。当肿瘤细胞与载有阿霉素的psinps(dox@psinps)一起孵育时，肿瘤细胞便会分泌载有dox@psinps的外泌体(dox@e-psinps)，dox@e-psinps对大量的癌细胞和癌症干细胞具有杀伤作用，从而起到抗肿瘤作用。外泌体也具有很多传统药物载体不具备的通过血脑屏障的能力。研究表明，脑内皮细胞产生的外泌体可作为治疗脑肿瘤药物的载体。在斑马鱼原发性脑癌模型中，装载抗癌药物的外泌体可通过血脑屏障发挥抗肿瘤作用，显著缩小肿瘤病灶大小并降低异种移植癌细胞的荧光强度和肿瘤生长标志物含量。利用基因修饰的外泌体来特异性地传递sirna，阻止kras基因突变，从而使患有胰腺癌的小鼠病情得到缓解，提高小鼠的存活率，证实外泌体能够作为一种高效的rna干扰(rnai)载体发挥作用，运送特异性地靶向kras的sirna和短发夹rna分子，比脂质体更加高效，且没有明显的免疫反应。

4、卵巢癌是常见的致死性妇科恶性肿瘤之一，在女性死亡相关的癌症病因中排名第5，常常因早期诊断困难、复发率高及化疗药物的耐药性，使卵巢癌患者预后较差，5年生存率仅约30％。外泌体作为一种生物活性物质的载体，在卵巢癌的治疗中具有很大的应用前景。首先外泌体作为细胞外的一种小囊泡，可以自由循环于生物体液中，比如血液、尿液、腹水、唾液和脑脊液中。其次外泌体的膜成分中还具有细胞膜的一个性能：最佳膜融合性能，在某些情况下还具有独特的细胞趋向性。并且来源于卵巢癌患者的外泌体在体外的聚乙二醇脂质体中，能够更好地发生免疫逃逸。通过进行体内外实验，利用纳米追踪分析和免疫印迹法分析外泌体，发现利用外泌体作为多柔比星的载体，相比单独多柔比星，心肌内皮细胞的外渗动力学相对缓慢；并且在存在免疫缺陷和具有免疫能力的小鼠中，对外泌体作为载体的多柔比星的容受剂量高于单纯的多柔比星。由此研究认为外泌体作为多柔比星载体，可以在不影响任何其他器官的情况下限制心脏毒性，增加乳腺癌和卵巢癌小鼠模型中多柔比星的治疗指数。卵巢癌作为妇科恶性疾病中最致死性病因，其中一部分的原因来自其化疗耐药，一些相关研究发现卵巢癌外泌体参与肿瘤化疗耐药的调节。研究发现铂类耐药的上皮性卵巢癌细胞中的外泌体可以转运一些自身化疗耐药的表型给铂类敏感细胞，增加耐药相关的emt和smad4的突变，这证实了外泌体是上皮性卵巢癌铂类耐药的调节者。而且，研究发现卵巢癌的外泌体mir21可以通过向邻近基质细胞转运，使得卵巢癌细胞产生化疗耐药和侵袭陛更强的表型，apafl是mir21的直接靶点，因此通过上调卵巢癌细胞的apafl，是可以增加卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感性。

技术实现思路

1、本发明一方面，制备并获得了脐带间充质干细胞外泌体。

2、进一步的，将化疗药物顺铂通过电击的方式导入到外泌体中，制备并获得了载药的外泌体。

3、更一步的，本发明提供了载药外泌体在制备用于治疗卵巢癌的药物中的用途。

4、更进一步的，本发明还通了特异性针对pi3k的单克隆抗体，该单克隆抗体能够特异性的抑制pi3k的信号通路，进而抑制卵巢癌细胞的增殖以及使其进行细胞凋亡。

5、更进一步的，本发明还提供了pi3k的单克隆抗体在制备治疗卵巢癌的药物中的用途。

6、进一步的，本发明的pi3k的单克隆抗体可抑制卵巢癌细胞p-akt蛋白的表达，p-akt是akt的活化形式，akt只有在活化状态时才有生物学特性，pi3k的单克隆抗体能通过抑制pi3k活性，进而减少akt的活化，阻止其下游的分子发生生物学效应,导致细胞的增殖减少、凋亡增加，进而治疗卵巢癌。

7、进一步的，本发明的单克隆抗体能够通过增加化疗药物的敏感性来提高二者协同的治疗效果。

8、因此，进一步的，本发明还提供了pi3k的单克隆抗体在提高顺铂对卵巢癌细胞sk-ov-3药物敏感性中的用途。

9、本发明还提供了一种用于治疗卵巢癌的药物组合物，所述药物组合物是由pi3k的单克隆抗体和负载了顺铂的外泌体组成。

10、进一步的，所述的药物组合物中还含有药学上可接受的载体。

11、进一步的，载体是一种或多种选自以下的成分：粘合剂、填充剂、润滑剂和成对泡腾成分(effervescent couple)、芯吸剂(wicking agent)、助流剂、崩解剂和润湿剂。

12、在本发明的上下文中，“用于口服给药”指的是药物组合物在易于整个吞咽的固体剂型中，并且在给药前基本不溶解或混悬在水中。

13、适宜的崩解剂将是本领域技术人员已知的，非限制性的实例包括交联羧甲基纤维素钠、淀粉羟乙酸钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、淀粉(例如玉米淀粉、预胶化淀粉)、低取代的羟丙基纤维素、海藻酸、海藻酸钠、三价磷酸钙、硫酸钙、羧甲基纤维素钙、微晶纤维素、粉状纤维素、二氧化硅胶体、多库酯钠、瓜尔胶、羟丙基纤维素、硅酸镁铝、甲基纤维素、聚克立林钾和聚乙烯吡咯烷酮。交联羧甲基纤维素钠是优选的。崩解剂可以单独使用或与其它物质组合。

14、有益效果

15、本发明提供了一种干细胞外泌体，所述外泌体通过负载化疗药物之后，能够有效的用于卵巢癌的治疗。将所述负载了化疗药物的外泌体与pi3k的单克隆抗体一起联用后，能够显著的提高化疗药物的敏感性，使得二者具有协同的显著的治疗优势，在应用前景上体现了较好的效果。