血液胞外囊泡microRNA在鉴别卵巢肿瘤良恶性中的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域。具体地说，本发明涉及用于早期诊断卵巢癌，特别是鉴别卵巢肿瘤良恶性的血液胞外囊泡mir-203a-3p及其应用。

背景技术：

1、卵巢癌(ovarian cancer，oc)是全球第三大最常见的妇科恶性肿瘤，但在妇科恶性肿瘤中死亡率最高。由于卵巢癌早期病变无特异性的症状，且缺乏有效的筛查方法，导致大多数患者诊断时已处于晚期。卵巢癌患者5年生存率约30％，预后较差，而i期卵巢癌患者大部分可通过手术治愈，5年生存率高达90％。因此，迫切需要高敏感性、高特异性的早期诊断生物标志物，助力我国卵巢癌的早诊，延长患者的生存期，提高患者的生存质量。

2、目前，卵巢癌的诊断方法包括组织病理学检查、细胞学检查、影像学检查、肿瘤标志物测定等。组织病理学活检是确诊卵巢癌的金标准，而对于不适合穿刺活检的患者可抽吸盆腔肿块或腹水进行细胞学检查。但穿刺活检会引起癌细胞的扩散和转移，而细胞学检查的敏感性只有穿刺活检的75％。影像学检查方法包括胸部、腹部、骨盆的电子计算机断层扫描(ct)、核磁共振成像(mri)、pet-ct、经阴道超声检查(tvs)、磁弛豫法(mrx)等，但影像学检测方法如ct对直径小于1cm肿块的灵敏度仅为25-50％，容易漏检早期的卵巢癌。肿瘤标志物测定包括ca125、he4、ca72.4、ca15.3等，有报道显示，在晚期卵巢癌中ca125水平升高的患者约占80％，而在早期卵巢癌中ca125水平升高的患者仅占50％，且月经或怀孕等生理条件下ca125水平也会升高。现有卵巢癌的诊断方法各有利弊，均有一定的局限性。

3、因此，开发高效特异性的生物标志物用于卵巢癌的早期诊断是非常必要且具有重要临床价值和意义的。

技术实现思路

1、本发明旨在通过二代测序技术，发现并验证高敏感性、高特异性的血液胞外囊泡mirna生物标志物，应用于卵巢癌的早诊，弥补现有诊断方法，如组织病理学检查、细胞学检查、影像学检查、肿瘤标志物测定等在卵巢癌早期诊断上的不足，为临床提供微创的早期诊断方法，提高我国卵巢癌早期诊断的准确性，减轻卵巢癌患者的经济负担、减少患者的痛苦，提高患者的存活率。

2、为此，本发明提供了一种生物标志物，这种生物标志物能够在临床上对卵巢肿瘤的良恶性进行鉴别。

3、本发明还提供了能够对卵巢肿瘤的良恶性进行鉴别的芯片和试剂盒。

4、本发明还提供了利用所述生物标志物对卵巢肿瘤的良恶性进行鉴别的方法。

5、在第一方面，本发明提供血液胞外囊泡mirna在制备鉴别上皮性卵巢肿瘤良恶性的芯片、检测试剂或检测试剂盒中的用途。

6、在具体的实施方式中，所述的血液胞外囊泡mirna是：

7、(i)序列如seq id no:1所示的mirna；或者

8、(ii)与(i)所述mirna序列互补的mirna。

9、在优选的实施方式中，所述的mirna是分离自人的mirna。

10、在第二方面，本发明提供一种mirna芯片，所述的mirna芯片包括：

11、固相载体；以及

12、有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地结合mirna；

13、其中，所述的mirna是：

14、(i)序列如seq id no:1所示的mirna；或者

15、(ii)与(i)所述mirna序列互补的mirna。

16、在具体的实施方式中，所述的寡核苷酸探针含有：

17、互补结合区；和/或

18、与固相载体相连的连接区。

19、在具体的实施方式中，所述mirna芯片用于鉴别上皮性卵巢肿瘤的良恶性。

20、在优选的实施方式中，所述的mirna是分离自人的mirna。

21、在优选的实施方式中，所述的mirna是血液胞外囊泡mirna。

22、在第三方面，本发明提供第二方面所述的mirna芯片的用途，用于制备鉴别上皮性卵巢肿瘤良恶性的检测试剂盒。

23、在第四方面，本发明提供一种检测试剂盒，所述的检测试剂盒装有检测mirna的检测试剂；

24、其中，所述的mirna是：

25、(i)序列如seq id no:1所示的mirna；或者

26、(ii)与(i)所述mirna序列互补的mirna；

27、或者，所述检测试剂盒装有第二方面所述的mirna芯片。

28、在具体的实施方式中，所述检测试剂盒用于鉴别上皮性卵巢肿瘤的良恶性。

29、在优选的实施方式中，所述的mirna是分离自人的mirna。

30、在优选的实施方式中，所述的mirna是血液胞外囊泡mirna。

31、在第五方面，本发明提供一种分离自血液胞外囊泡的mirna，用于鉴别上皮性卵巢肿瘤良恶性；

32、其中，所述的mirna是：

33、(i)序列如seq id no:1所示的mirna；或者

34、(ii)与(i)所述mirna序列互补的mirna。

35、在优选的实施方式中，所述的mirna是分离自人的mirna。

36、在优选的实施方式中，所述的mirna是血液胞外囊泡mirna。

37、在第六方面，本发明提供一种鉴别卵巢肿瘤良恶性的方法，包括步骤：

38、(a)根据训练队列mirna表达量数据，结合病理检测结果，构建良/恶性分类模型；

39、(b)以待测对象mirna表达量为变量，结合参比值，当风险值小于或等于参比值时则判定该对象为良性，否则为恶性卵巢癌；

40、所述的mirna是：

41、(i)序列如seq id no:1所示的mirna；或者

42、(ii)与(i)所述mirna序列互补的mirna。。

43、在优选的实施方式中，所述参比值为4.30。

44、在优选的实施方式中，所述的mirna是分离自人的mirna。

45、在优选的实施方式中，所述的mirna是血液胞外囊泡mirna。

46、在第七方面，本发明提供一种分离自血液胞外囊泡的mirna，所述的mirna是：

47、(i)序列如seq id no:1所示的mirna；或者

48、(ii)与(i)所述mirna序列互补的mirna。

49、在优选的实施方式中，所述的mirna是分离自人的mirna。

50、在优选的实施方式中，所述的mirna是血液胞外囊泡mirna。

51、在第八方面，本发明提供一种分离的或人工构建的前体mirna，所述的前体mirna能在人细胞内剪切并表达成所述的mirna。

52、在第九方面，本发明提供一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸能被人细胞转录成前体mirna，所述的前体mirna能在人细胞内被剪切且表达成所述的mirna。

53、在优选的实施方式中，所述的多核苷酸具有式i所示的结构：

54、seq正向-x-seq反向   式i

55、式i中，

56、seq正向为能在人细胞中表达成所述的mirna的核苷酸序列；

57、seq反向为与seq正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；

58、x为位于seq正向和seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与seq正向和seq反向不互补；

59、式i所示的结构在转入人细胞后，形成式ii所示的二级结构：

60、

61、式ii中，seq正向、seq反向和x的定义如上述，

62、||表示在seq正向和seq反向之间形成的碱基互补配对关系。

63、在第十方面，本发明提供一种载体，所述载体含有所述的mirna或所述的多核苷酸。

64、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。