氨基转移酶突变体和制备手性胺类化合物的方法与流程

本发明属于酶工程，特别涉及了一种氨基转移酶突变体、以及使用氨基转移酶或氨基转移酶突变体制备手性胺类化合物的方法。

背景技术：

1、七环手性胺是多种临床阶段药物的手性前体。合成方法是用非手性的还原胺化，再依赖化学拆分得到。原子经济性较低、价格较高，且为远端手性收率,收率非常低(收率<30％)。目前针对(s)-手性的七环并苯基手性胺没有天然酶或已报道的人工酶可以合成。

2、因此，本领域亟需一种立体选择性高的氨基转移酶产生手性对映体的手性胺的方法。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于现有技术中的氨基转移酶在合成手性胺类化合物特别是七环手性胺类化合物时反应收率低的问题，进一步在于立体选择性差、转化率低的问题。为此，本发明提供了一种氨基转移酶突变体，以及使用氨基转移酶或氨基转移酶突变体制备手性胺类化合物的方法。本发明氨基转移酶及氨基转移酶突变体，用于制备手性芳基胺类化合物时，具有以下一种或多种优点：条件温和、选择性高、成本低、原料转化率高、收率高且产物手性纯度高。

2、为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种氨基转移酶突变体，所述的氨基转移酶突变体由如seq id no:1所示的氨基酸序列中发生选自以下位点的一个或多个突变得到：第2位、第3位、第4位、第5位、第6位、第18位、第19位、第20位、第25位、第26位、第27位、第28位、第31位、第44位、第45位、第47位、第51位、第53位、第54位、第55位、第56位、第57位、第58位、第59位、第63位、第64位、第66位、第67位、第73位、第76位、第77位、第78位、第79位、第81位、第83位、第84位、第85位、第86位、第87位、第88位、第89位、第90位、第91位、第95位、第97位、第98位、第101位、第102位、第105位、第107位、第108位、第109位、第110位、第115位、第116位、第117位、第118位、第119位、第120位、第121位、第122位、第124位、第126位、第129位、第130位、第133位、第134位、第135位、第137位、第139位、第141位、第149位、第150位、第151位、第152位、第153位、第154位、第155位、第156位、第157位、第158位、第160位、第161位、第163位、第164位、第165位、第166位、第167位、第168位、第169位、第170位、第180位、第181位、第184位、第186位、第190位、第195位、第196位、第199位、第203位、第204位、第208位、第210位、第211位、第212位、第222位、第223位、第224位、第225位、第226位、第227位、第228位、第229位、第236位、第240位、第241位、第244位、第248位、第250位、第256位、第257位、第258位、第259位、第260位、第264位、第267位、第268位、第272、第275位、第281位、第282位、第283位、第284位、第285位、第286位、第291位、第292位、第293位、第294位、第295位、第301位、第302位、第305位、第312位、第313位、第314位、第315位、第316位、第317位、第318位、第319位、第320位、第321位、第322位、第323位、第324位、第332位、第338位、第341位、第342位、第343位、第348位、第350位、第351位、第355位、第357位、第358位、第361位、第362位、第365位、第366位、第372位、第374位、第385位、第386位、第388位、第390位、第391位、第392位、第394位、第395位、第396位、第397位、第398位、第401位、第402位、第405位、第409位、第410位、第413位、第414位、第415位、第416位、第418位、第424位、第431位、第432位、第439位、第443位、第447位、第450位、第451位、第453位。

4、在一些优选的实施例中，所述的氨基转移酶突变体由如seq id no:1所示的氨基酸序列中发生1～7个位点的一个或多个突变得到。

5、在一些优选的实施例中，所述的氨基转移酶突变体由如seq id no:1所示的氨基酸序列中发生选自以下位点的一个或多个突变得到：第115位、第133位、第150位、第163位、第272位、第391位、第395位。

6、在一些优选的实施例中，所述的突变为缺失、增加或替换，优选为替换。

7、在一些优选的实施例中，所述氨基转移酶突变体为在如seq id no:1所示的氨基酸序列的第2位氨基酸残基替换为e、f、g或v，和/或，第3位氨基酸残基替换为d、e、i、n、t或v，和/或，第4位氨基酸残基替换为k、q、r、s、t或v，和/或，第5位氨基酸残基替换为e、i、m、q或v，和/或，第6位氨基酸残基替换为d、f、h、l、n、s或v，和/或，第18位氨基酸残基替换为d或g，和/或，第19位氨基酸残基替换为l、m、q或s，和/或，第20位氨基酸残基替换为c、e、k或p，和/或，第25位氨基酸残基替换为t或v，和/或，第26位氨基酸残基替换为e、f、i、k、q或v，和/或，第27位氨基酸残基替换为f、g、l、n、s或w，和/或，第28位氨基酸残基替换为s或t，和/或，第31位氨基酸残基替换为k、r或v，和/或，第44位氨基酸残基替换为i或k，和/或，第45位氨基酸残基替换为d、e、h或k，和/或，第47位氨基酸残基替换为g、p或s，和/或，第51位氨基酸残基替换为h、k、q或s，和/或，第53位氨基酸残基替换为h或k，和/或，第54位氨基酸残基替换为a、g、h、i、k、m、p或q，和/或，第55位氨基酸残基替换为a、m、q或t，和/或，第56位氨基酸残基替换为i、n、q、v或w，和/或，第57位氨基酸残基替换为f、p或t，和/或，第58位氨基酸残基替换为h、q、s或v，和/或，第59位氨基酸残基替换为m、s或y，和/或，第63位氨基酸残基替换为s、t、v或y，和/或，第64位氨基酸残基替换为d、k、q、r、v、w或y，和/或，第66位氨基酸残基替换为e或i，和/或，第67位氨基酸残基替换为a、c、e、n、s、v或w，和/或，第73位氨基酸残基替换为l、n、w或y，和/或，第76位氨基酸残基替换为d、k、q、r、v、w或y，和/或，第77位氨基酸残基替换为g、h、m、r或v，和/或，第78位氨基酸残基替换为a、l或r，和/或，第79位氨基酸残基替换为c、e、h、k、l、v或y，和/或，第81位氨基酸残基替换为i或v，和/或，第83位氨基酸残基替换为a、f、h、i、p或s，和/或，第84位氨基酸残基替换为c、e、g、h、i、l、q、s、w或y，和/或，第85位氨基酸残基替换为a、k、s或w，和/或，第86位氨基酸残基替换为k、l或v，和/或，第87位氨基酸残基替换为c、r或y，和/或，第88位氨基酸残基替换为c、g、h、k、m、r、s、t或v，和/或，第89位氨基酸残基替换为a、n或s，和/或，第90位氨基酸残基替换为c、p、q、t或y，和/或，第91位氨基酸残基替换为f、g、l或p，和/或，第95位氨基酸残基替换为d、g、k、r或t，和/或，第97位氨基酸残基替换为a、e、i、k、p或t，和/或，第98位氨基酸残基替换为a、q、s或v，和/或，第101位氨基酸残基替换为c、f、h、l、n、p、q或y，和/或，第102位氨基酸残基替换为c、f、g、k、n或y，和/或，第102位氨基酸残基替换为n或y，和/或，第105位氨基酸残基替换为f、h、q或r，和/或，第107位氨基酸残基替换为e或r，和/或，第108位氨基酸残基替换为c、i、l、m、n、s或w，和/或，第109位氨基酸残基替换为e、f、g、r、s、t或w，和/或，第110位氨基酸残基替换为c、l、q或s，和/或，第115位氨基酸残基替换为a、d、e、l、m、p、w或y，和/或，第116位氨基酸残基替换为c、f、n、q、r或v，和/或，第117位氨基酸残基替换为a、k、l、n、q、v、w或y，和/或，第118位氨基酸残基替换为a、h、t或y，和/或，第119位氨基酸残基替换为d、i、l或v，和/或，第120位氨基酸残基替换为c、m、r或t，和/或，第121位氨基酸残基替换为e、m、p或q，和/或，第122位氨基酸残基替换为i、l或p，和/或，第124位氨基酸残基替换为a或k，和/或，第126位氨基酸残基替换为a、r或t，和/或，第129位氨基酸残基替换为f、g或n，和/或，第130位氨基酸残基替换为g、h、m、r或t，和/或，第133位氨基酸残基替换为d、f、g、i、k、t或y，和/或，第134位氨基酸残基替换为a、d、l或n，和/或，第135位氨基酸残基替换为c、f、i、k或m，和/或，第137位氨基酸残基替换为e、f、g、h、m、s或w，和/或，第139位氨基酸残基替换为e、k、m、p或v，和/或，第141位氨基酸残基替换为h或k，和/或，第149位氨基酸残基替换为a、c、d或p，和/或，第150位氨基酸残基替换为c、e、l、m、q、s或w，和/或，第151位氨基酸残基替换为a、d、i、l、q、r或s，和/或，第152位氨基酸残基替换为e、f、k、s、t或v，和/或，第153位氨基酸残基替换为f、k、l、m、n、q或v，和/或，第154位氨基酸残基替换为c、f、g或t，和/或，第155位氨基酸残基替换为c、m、r或v，和/或，第156位氨基酸残基替换为h、r、w或y，和/或，第157位氨基酸残基替换为h、n、p或y，和/或，第158位氨基酸残基替换为c、m、p、q、s、t或y，和/或，第160位氨基酸残基替换为c、i、k、l、m或s，和/或，第161位氨基酸残基替换为e、g、r、s或v，和/或，第163位氨基酸残基替换为a、d、h、l或v，和/或，第164位氨基酸残基替换为e、g、m、w或y，和/或，第165位氨基酸残基替换为d或s，和/或，第166位氨基酸残基替换为f、p或v，和/或，第167位氨基酸残基替换为a、c、s或t，和/或，第168位氨基酸残基替换为e、h、q、t或y，和/或，第169位氨基酸残基替换为c、h、i、r或s，和/或，第170位氨基酸残基替换为i、l、m、n或y，和/或，第180位氨基酸残基替换为e、h、l、n、q、r、s、t或y，和/或，第181位氨基酸残基替换为f、h、l或t，和/或，第184位氨基酸残基替换为e或s，和/或，第186位氨基酸残基替换为g、k、p或q，和/或，第190位氨基酸残基替换为d、f、l、n、q、t或w，和/或，第195位氨基酸残基替换为i、p或w，和/或，第196位氨基酸残基替换为a、e或q，和/或，第199位氨基酸残基替换为d或t，和/或，第203位氨基酸残基替换为a、h、l、n、p、q、r或w，和/或，第204位氨基酸残基替换为e、k或q，和/或，第208位氨基酸残基替换为i、k、m或w，和/或，第210位氨基酸残基替换为d、l、n、t、e、q或w，和/或，第211位氨基酸残基替换为e、q或w，和/或，第212位氨基酸残基替换为i、k、n或t，和/或，第222位氨基酸残基替换为g、k、l、q或s，和/或，第223位氨基酸残基替换为c、e或q，和/或，第224位氨基酸残基替换为a、c、q或r，和/或，第225位氨基酸残基替换为d、h或n，和/或，第226位氨基酸残基替换为i或r，和/或，第227位氨基酸残基替换为f或y，和/或，第228位氨基酸残基替换为f、n、r或w，和/或，第229位氨基酸残基替换为i、q或v，和/或，第236位氨基酸残基替换为c，和/或，和/或，第240位氨基酸残基替换为a、h、l、p、t或y，和/或，第241位氨基酸残基替换为w，和/或，第244位氨基酸残基替换为a、c或g，和/或，第248位氨基酸残基替换为i，和/或，第250位氨基酸残基替换为a、d、g、h或w，和/或，第256位氨基酸残基替换为g、h、l或q，和/或，第257位氨基酸残基替换为w，和/或，第258位氨基酸残基替换为f、h、k、l或r，和/或，第259位氨基酸残基替换为d，和/或，第260位氨基酸残基替换为a、q、r、s或t，和/或，第264位氨基酸残基替换为c或g，和/或，第267位氨基酸残基替换为k、n、q或v，和/或，第268位氨基酸残基替换为f、g、m或t，和/或，第272位氨基酸残基替换为e、f、g、i、l、q或s，和/或，第275位氨基酸残基替换为d、f、g或t，和/或，第281位氨基酸残基替换为l、m或q，和/或，第282位氨基酸残基替换为a、f、g、k、l、t或v，和/或，第283位氨基酸残基替换为f、k、t、v或y，和/或，第284位氨基酸残基替换为e或n，和/或，第285位氨基酸残基替换为m，和/或，第286位氨基酸残基替换为a、d、g、h、m、s、v或y，和/或，第291位氨基酸残基替换为y，和/或，第292位氨基酸残基替换为i、l、s、t或v，和/或，第293位氨基酸残基替换为a、f、g、p、q、s或t，和/或，第294位氨基酸残基替换为a、i、l、m、n、p或r，和/或，第295位氨基酸残基替换为h、p或q，和/或，第301位氨基酸残基替换为c、f、r或t，和/或，第302位氨基酸残基替换为a、d、h、i、w或y，和/或，第305位氨基酸残基替换为d、p或v，和/或，第312位氨基酸残基替换为h、i、k或t，和/或，第313位氨基酸残基替换为n、q、v或w，和/或，第314位氨基酸残基替换为i或t，和/或，第315位氨基酸残基替换为a、c、i、l、n或v，和/或，第316位氨基酸残基替换为d、n或t，和/或，第317位氨基酸残基替换为f、r或w，和/或，第318位氨基酸残基替换为a、e、g、h、i或y，和/或，第319位氨基酸残基替换为e、k、n或p，和/或，第320位氨基酸残基替换为c、e、f、p、s、v或y，和/或，第321位氨基酸残基替换为f、i、m、p或t，和/或，第322位氨基酸残基替换为d或i，和/或，第323位氨基酸残基替换为d、e、m、n、p或y，和/或，第324位氨基酸残基替换为n，和/或，第332位氨基酸残基替换为a、h、l、m或t，和/或，第338位氨基酸残基替换为e、q或y，和/或，第341位氨基酸残基替换为p、t或v，和/或，第342位氨基酸残基替换为c，和/或，第343位氨基酸残基替换为e、f、i、n、p、q或r，和/或，第348位氨基酸残基替换为h、p或r，和/或，第350位氨基酸残基替换为a、g、n或r，和/或，第351位氨基酸残基替换为h、l、p、r或w，和/或，第355位氨基酸残基替换为f、k、l、p、q、r或y，和/或，第357位氨基酸残基替换为a、g、i、s或y，和/或，第358位氨基酸残基替换为a、d、f、k、n、p、q、r或v，和/或，第361位氨基酸残基替换为a、i、p或y，和/或，第362位氨基酸残基替换为l、r或w，和/或，第365位氨基酸残基替换为y，和/或，第366位氨基酸残基替换为c，和/或，第372位氨基酸残基替换为a、c、g、h、t或v，和/或，第374位氨基酸残基替换为a、c、h、k或s，和/或，第385位氨基酸残基替换为d、e、r或s，和/或，第386位氨基酸残基替换为e、h、n或r，和/或，第388位氨基酸残基替换为g、i、s、v或w，和/或，第390位氨基酸残基替换为f、r、s或y，和/或，第391位氨基酸残基替换为a、e、h、i、m、p、s、v或w，和/或，第392位氨基酸残基替换为c、e、r或s，和/或，第394位氨基酸残基替换为g、l或q，和/或，第395位氨基酸残基替换为a、c、d、k、l、m、n、r、s、t或v，和/或，第396位氨基酸残基替换为a、f、g、s、t或w，和/或，第397位氨基酸残基替换为e、n、r或w，和/或，第398位氨基酸残基替换为g、r或s，和/或，第401位氨基酸残基替换为c、g、q、r、t或w，和/或，第402位氨基酸残基替换为a、g、i、l、p或v，和/或，第402位氨基酸残基替换为a、g、i、l、p或v，和/或，第405位氨基酸残基替换为i、l、r、s或w，和/或，第409位氨基酸残基替换为l、r或t，和/或，第410位氨基酸残基替换为h、k、l、n、v或w，和/或，第413位氨基酸残基替换为a、c、d、i、k、l、m、p、q、t或y，和/或，第414位氨基酸残基替换为i、l、m、s或y，和/或，第415位氨基酸残基替换为e、q或y，和/或，第416位氨基酸残基替换为g或m，和/或，第418位氨基酸残基替换为a、f、h、i、m、n、w或y，和/或，第424位氨基酸残基替换为e、i、m或s，和/或，第431位氨基酸残基替换为e或t，和/或，第432位氨基酸残基替换为e、f、h、i、n、q、v或y，和/或，第439位氨基酸残基替换为c、f、h、m、r或y，和/或，第443位氨基酸残基替换为f或l，和/或，第447位氨基酸残基替换为c、e、f、m或q，和/或，第450位氨基酸残基替换为a、g、i或m，和/或，第451位氨基酸残基替换为d、k、l或s，和/或，第453位氨基酸残基替换为r。

8、在一些优选的实施例中，所述氨基转移酶突变体为在如seq id no:1所示的氨基酸序列的第115位氨基酸残基替换为a、d、e、l、m、p、w或y，和/或，第133位氨基酸残基替换为d、f、g、i、k、t或y，和/或，第150位氨基酸残基替换为c、e、l、m、q、s或w，和/或，第163位氨基酸残基替换为a、d、h、l或v，和/或，第272位氨基酸残基替换为e、f、g、i、l、q或s，和/或，第391位氨基酸残基替换为a、e、h、i、m、p、s、v或w，和/或，第395位氨基酸残基替换为a、c、d、k、l、m、n、r、s、t或v。

9、在一些优选的实施例中，所述氨基转移酶突变体为在如seq id no:1所示的氨基酸序列的第115位氨基酸残基替换为p，和/或，第133位氨基酸残基替换为k，和/或，第150位氨基酸残基替换为w，和/或，第163位氨基酸残基替换为l，和/或，第272位氨基酸残基替换为e，和/或，第391位氨基酸残基替换为a，和/或，第395位氨基酸残基替换为c。

10、在一些优选的实施例中，所述氨基转移酶突变体在如seq id no:1所示的氨基酸序列上的差异如表1所示：

11、表1

12、

13、

14、

15、

16、

17、

18、

19、

20、

21、

22、

23、本发明还提供了一种分离的核酸，其中所述核酸编码为如上所述的氨基转移酶突变体。

24、本发明还提供了一种重组表达载体，其中所述重组表达载体包含如上所述的核酸。

25、本发明还提供了一种转化体，其中所述转化体包含如上所述的重组表达载体。

26、本发明还提供了一种制备氨基转移酶突变体的方法，其培养如上所述的转化体并获得含氨基转移酶突变体的培养物。

27、本发明还提供了一种氨基转移酶或如上所述的氨基转移酶突变体在制备手性胺类化合物中的应用；所述氨基转移酶的氨基酸序列如seq id no:1所示。

28、本发明还提供了一种制备手性胺类化合物的方法，其包括如下步骤：在氨基转移酶或如上所述的氨基转移酶突变体的存在下，将式ii化合物和氨基供体在溶剂中进行转氨反应，得式i化合物即可；

29、

30、其中，x为n(r1)，y为c；

31、或者，为

32、r1为氨基保护基；

33、所述氨基转移酶的氨基酸序列如seq id no:1所示。

34、在一些实施方案中，在所述的转氨反应中，所述r1可为本领域此类反应常规的氨基保护基，优选为-ac、-bz、-bn、-cbz或-boc，更优选为-boc。

35、在一些实施方案中，在所述的转氨反应中，所述式i化合物优选为相应的，所述式ii化合物优选为

36、在一些实施方案中，所述的溶剂可为本领域此类反应常规的溶剂，优选为缓冲液。所述的缓冲液可本领域常规的缓冲液，例如为选自磷酸盐缓冲液(pbs)、三羟甲基甲胺盐缓冲液(tris)和三乙醇胺盐缓冲液(teoa)中的一种或多种，优选为磷酸盐缓冲液、三羟甲基甲胺盐缓冲液或三乙醇胺盐缓冲液，更优选为磷酸盐缓冲液。

37、在一些实施方案中，所述磷酸盐缓冲液的摩尔浓度可为本领域此类缓冲液常规的摩尔浓度，优选为1mol/l。

38、在一些实施方案中，所述三羟甲基甲胺盐缓冲液的摩尔浓度可为本领域此类缓冲液常规的摩尔浓度，优选为0.2mol/l。

39、在一些实施方案中，所述三乙醇胺盐缓冲液的摩尔浓度可为本领域此类缓冲液常规的摩尔浓度，优选为1mol/l。

40、在一些实施方案中，所述缓冲液与所述式ii化合物的体积质量比可为本领域此类反应常规的体积质量比，优选为10～300ml/g，更优选为17.5～100ml/g，例如为17.5ml/g、30ml/g、50ml/g、60ml/g、70ml/g、90ml/g或100ml/g；进一步优选为60～100ml/g，例如为60ml/g、70ml/g、90ml/g或100ml/g。

41、在一些实施方案中，所述氨基转移酶或氨基转移酶突变体与所述式ii化合物的质量比可为本领域此类反应常规的质量比，优选为(0.1～5)：1，例如为0.25:1、0.5:1、1:1或2:1，更优选为(1～2)：1，例如为1:1或2:1。

42、在一些实施方案中，所述的氨基供体可为本领域此类反应常规的氨基供体，例如为选自异丙胺、三乙醇胺或三羟甲基氨基甲烷中的一种或多种，优选为异丙胺、三乙醇胺或三羟甲基氨基甲烷，更优选为异丙胺。

43、在一些实施方案中，所述氨基供体与所述式ii化合物的摩尔比可为本领域此类反应常规的摩尔比，例如为(1～3)：1，优选为2:1。

44、在一些实施方案中，所述转氨反应的体系ph值可为本领域此类反应常规的ph值，优选为7～11，例如为7、8.5、9、9.5或10，更优选9～10，最优选为9、9.5或10。

45、在一些实施方案中，所述缓冲液的ph值可为本领域此类反应常规的ph值，优选为7～11，例如为7、8.5、9、9.5或10，更优选9～10，最优选为9、9.5或10。

46、在一些实施方案中，所述的转氨反应还可进一步包括助溶剂，所述的助溶剂可为本领域此类反应常规的助溶剂，能溶解式ii化合物即可，例如为砜类溶剂，优选为dmso。所述助溶剂与所述式ii化合物的体积质量比可为本领域此类反应常规的体积质量比，优选为10～500ml/g，更优选10ml/g～30ml/g，例如为10ml/g、20ml/g或30ml/g。

47、在一些实施方案中，所述的转氨反应还可进一步包括磷酸吡哆醛(plp)，其中所述磷酸吡哆醛与所述式ii化合物的质量比可为本领域此类反应常规的质量比，优选为1:(100～10)，更优选为1:(20～10)，例如为1:20、3:40或1:10；进一步优选为1:(15～10)，例如为3:40或1:10。

48、在一些实施方案中，所述转氨反应的反应温度可为本领域此类反应常规的反应温度，例如为20～50℃，优选为45～50℃。

49、在一些实施方案中，所述转氨反应的反应时间可为本领域此类反应常规的反应时间中，例如为以所述式ii化合物消失或不再反应所需要的反应时间，优选为4～42h，更优选30～42h。

50、在一些实施方案中，所述制备手性胺类化合物的方法，其包括以下步骤：向所述的缓冲液和氨基供体的混合液中，加入式ii化合物和氨基转移酶或氨基转氨酶突变体，混合均匀后在20℃～50℃下反应即可。

51、在一些实施方案中，所述的转氨反应结束后还可包括以下后处理步骤：去除所述转氨反应过程中产生的丙酮，用碱调节水相ph值至12～14，再加入有机溶剂萃取得有机相，并干燥、过滤即可。所述ph值优选为13。所述有机溶剂可为本领域此类萃取常用的有机溶剂，优选为二氯甲烷。所述的碱可为本领域此类操作常用的碱，例如为氢氧化钾和/或氢氧化钠，优选浓度为10m的氢氧化钾。

52、本发明中的氨基酸简写符号如无特殊说明均为本领域常规，具体简写符号对应的氨基酸如表2所示。

53、表2

54、

55、

56、本发明的积极进步效果在于：本发明通过基因工程对一种氨基转移酶进行定向进化，得到若干具有更高活性的立体特异性的氨基转移酶突变体，本发明使用氨基转移酶或氨基转移酶突变体制备手性胺类化合物的方法，具有以下一种或多种优点：条件温和、选择性高、成本低、原料转化率高、收率高且产物手性纯度高，进一步的，所述手性胺类化合物，其e.e.值最高可达到99％，收率最高可达到98.36％，纯度大于98％，实现了利用生物催化法的生产技术。

57、在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

58、本发明所用试剂和原料均市售可得。