检测牛结节性皮肤病病毒抗体的试剂及其所用多肽的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及检测牛结节性皮肤病病毒抗体的试剂及其所用多肽。


背景技术：

2.结节性皮肤病(lsd)首次于1929年在赞比亚首次发生，之后主要在撒哈拉和马达加斯加等非洲国家和地区呈地方流行，并于1989年和2006年在以色列发生，之后不断蔓延至伊朗、巴基斯坦、沙特阿拉伯等国家。2015年先后在希腊和俄罗斯爆发，并在包括俄罗斯、哈萨克斯坦、土耳其、叙利亚和以色列等中亚和欧洲国家传播，对我国构成严重威胁。过去十年里，中东、欧洲以及西亚地区报道了lsd的发生(oie，2017)。结节性皮肤病爆发趋于零星发生，取决于动物的活动、免疫状况以及影响媒介昆虫种群数量的风和降雨变化等因素。主要传播方式为节肢动物媒介的机械性传播。2019年8月12日，经中国动物卫生与流行病学中心国家外来动物疫病研究中心确诊，新疆维吾尔自治区伊犁州发生牛结节性皮肤病疫情，这是我国首次确诊大规模发生该病。
3.牛结节性皮肤病病毒(lsdv)与山羊痘病毒(goatpox virus，gpv)、绵羊痘病毒(sheeppox virus，spv)同属于痘病毒科(poxviridae)、山羊痘病毒属(capripoxvirus，capv)。电镜下观察，病毒粒子呈砖块状或短管状，由1个核、2个侧体和2层脂质外膜组成，大小约为290nm
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270nm，属于较小的痘病毒病毒粒子。该病毒只有1个血清型，代表毒株为南非neethling株。该病毒可在羔羊、犊牛肾或辜丸细胞、绵羊胚胎肾和肺细胞、鸡胚成纤维细胞等原代细胞，以及牛肾细胞、非洲绿猴肾等传代细胞中增殖并产生细胞病变。感染的细胞培养物用苏木素与伊红或苏木素与玫瑰红染色，可见胞浆内包涵体。病毒可在鸡胚绒毛尿囊膜上生长繁殖，并引起痘斑，但鸡胚不死亡。该病毒具有细胞结合特性，采用超声波破坏细胞，可使病毒释放到细胞外。病毒粒子可于ph＝6.6～8.6环境中长期存活。在4℃甘油盐水和组织培养液内存活4～6个月。干燥病变中的病毒存活1个月以上，在干燥圈舍内可存活几个月。病毒耐冻融，置-20℃以下保存可保持活力达几年之久，在-80℃可保存10年。对热敏感，55℃2h或65℃30min可灭活。对直射阳光、酸、碱和大多数常用消毒药(酒精、升汞、碘酊、来苏尔、福尔马林、石炭酸等)均较敏感，对氯仿和乙醚也敏感。
4.lsdv的自然宿主主要是牛，各品种牛均易感，无明显的品种特异性。家兔、绵羊、山羊、长颈鹿和黑羚羊等也可能被感染，但没有证据表明lsdv能感染人。lsdv能感染所有的牛类，发病率5％～85％，死亡率可达20％，其中泌乳牛发病最严重，导致泌乳牛产奶量显著下降。由于睾丸炎和睾丸萎缩，可致公牛永久性或暂时性不育，并通过精液长期排毒。
5.临床和亚临床病牛是主要的传播来源，其中活牛移动是广泛传播的重要原因，如放牧或上市交易等。lsdv广泛存在于皮肤、真皮损伤部位、结痴、唾液、鼻汁、牛乳、精液、肌肉、脾脏、淋巴结等处。眼、鼻、口、直肠、乳腺和生殖器等形成溃疡时，其结节迅速溃烂，其分泌物中都含有病毒粒子，如暴露到发病动物产生的气溶胶，即可被感染。
6.该病自然感染的潜伏期2～5周，试验感染的为4～12d，通常为7d。病牛体温升高，
可达41℃以上，呈持续稽留热型。初期表现为鼻炎、结膜炎、角膜炎。试验性感染后第4～12天体表皮肤出现硬实、圆形、隆起、直径1～5cm的结节，触摸有痛感，尤其是头部、颈部、胸部、会阴、乳房和四肢。皮肤结节位于表皮和真皮，可集聚成不规则的肿块，最后坏死。病牛体表淋巴结肿大，以肩前、腹股沟外、股前、后肢和耳下淋巴结最为突出。眼、鼻、口腔、直肠、乳房和外生殖器等处黏膜也可形成结节和溃疡。泌乳牛可发生乳房炎，泌乳量下降，孕牛发生流产，公牛病后不育，肉牛生产性能下降，坏死性结节易受苍蝇叮咬，脱落后在皮肤上留下深洞，皮张无法利用。解剖皮下组织可见灰红色浆液浸润。切开结节，腔内含有干酪样灰白色的坏死组织，有的有脓血，结节深达皮下组织或至肋骨组织。体表、咽、气管、肺、瘤胃、皱胃、肾脏表面都可能有类似的结节。在病初，受损细胞内可见嗜酸性包涵体。根据这些临床症状和病理变化特征可以进行初步诊断，但确诊需要进一步进行实验室病原学和血清学检测。
7.主要鉴别诊断为牛疱疹病毒2型(bohv-2)引起的假性lsd。这通常是一种较温和的临床症状，以浅层结节为特征，仅类似于lsd的早期阶段。核内包涵体和病毒合胞体是lsd中未见过的bohv-2感染的组织病理学特征。其他鉴别诊断(针对皮肤病变)包括：皮肤病、皮肤癣菌病、牛皮藓、光敏症、放线杆菌病、荨麻疹、昆虫叮咬、贝氏丝虫病、诺卡氏菌病、蠕形螨病、盘尾丝虫病、假牛痘和牛痘。黏膜病变的鉴别诊断包括：口蹄疫、蓝舌病、牛病毒性腹泻、恶性卡他热、牛传染性鼻气管炎和牛流行性口炎。


技术实现要素：

8.本发明所要解决的一个技术问题是如何提高牛结节性皮肤病病毒抗体检测的敏感性与特异性，从而更准确地诊断牛结节性皮肤病。
9.为了解决上述技术问题，本发明提供了用于制备牛结节性皮肤病病毒抗体检测试剂的成套多肽或用于制备牛结节性皮肤病病诊断试剂的成套多肽。
10.第一方面，本发明要求保护多肽或成套多肽。
11.本发明所要求保护的多肽为ea27-1多肽。
12.本发明所要求保护的成套多肽由所述ea27-1多肽和ea33-1多肽组成。
13.所述ea27-1多肽为如下p11、p12或p13所示：
14.p11、氨基酸序列为seq id no.1的多肽，
15.p12、氨基酸序列为seq id no.1的第2-28位的多肽，
16.p13、在p12所示多肽的氨基末端或羧基末端连接氨基酸残基后得到的能够与载体蛋白偶联的多肽。
17.所述ea33-1多肽为如下p21、p22或p23所示：
18.p21、氨基酸序列为seq id no.5的多肽，
19.p22、氨基酸序列为seq id no.5的第2-33位的多肽，
20.p23、在p22所示多肽的氨基末端或羧基末端连接氨基酸残基后得到的能够与载体蛋白偶联的多肽。
21.其中，seq id no.1由28个氨基酸残基组成，第1位的半胱氨酸残基是为了与载体蛋白连接添加的连接臂，其它氨基酸残基来源于牛结节性皮肤病病毒a27蛋白；seq id no.5由33个氨基酸残基组成，第1位的半胱氨酸残基是为了与载体蛋白连接添加的连接臂，
其它氨基酸残基来源于牛结节性皮肤病病毒a33蛋白。
22.第二方面，本发明要求保护偶联物或成套偶联物。
23.本发明所要求保护的偶联物为ea27-1偶联物。
24.本发明所要求保护的成套偶联物由所述ea27-1偶联物和ea33-1偶联物组成。
25.所述ea27-1偶联物为由前文第一方面中所述ea27-1多肽和载体蛋白偶联得到的完全抗原；所述ea33-1偶联物为由前文第一方面中所述ea33-1多肽和载体蛋白偶联得到的完全抗原。
26.在本发明的一个具体实施方式中，所述成套偶联物中所述ea27-1偶联物和所述ea33-1偶联物的质量比为1：1。
27.其中，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、血蓝蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白、鼠血清白蛋白、甲状腺球蛋白或兔血清白蛋白等。
28.在本发明的一个具体实施方式中，所述载体蛋白为牛血清白蛋白(bsa)。
29.第三方面，本发明要求保护前文第一方面所述的多肽或成套多肽或前文第二方面所述的偶联物或成套偶联物在如下任一中的应用：
30.(a1)制备检测牛结节性皮肤病病毒抗体的试剂或试剂盒；
31.(a2)制备牛结节性皮肤病病毒诊断抗原。
32.第四方面，本发明要求保护含有前文第一方面所述的多肽或成套多肽或前文第二方面所述的偶联物或成套偶联物的试剂盒。
33.进一步地，所述试剂盒用于检测牛结节性皮肤病病毒抗体；在所述试剂盒中，前文第一方面所述的多肽或成套多肽或前文第二方面所述的偶联物或成套偶联物作为包被抗原。
34.更进一步地，所述试剂盒可为化学发光免疫分析试剂盒；所述试剂盒中还可含有辣根过氧化物酶(hrp)标记二抗、包被缓冲液、洗涤液、二抗稀释液和/或校准品；所述二抗为能够抗所述牛结节性皮肤病病毒抗体的抗体。
35.第五方面，本发明要求保护如下任一生物材料：
36.(b1)核酸分子，为核酸分子1或核酸分子2；所述核酸分子1为能够编码前文第一方面中所述ea27-1多肽的核酸分子；所述核酸分子2为能够编码前文第一方面中所述ea33-1多肽的核酸分子；
37.(b2)表达盒，为表达盒1或表达盒2；所述表达盒1为含有(b1)中所述核酸分子1的表达盒；所述表达盒2为含有(b1)中所述核酸分子2的表达盒；
38.(b3)重组载体，为重组载体1或重组载体2；所述重组载体1为含有(b1)中所述核酸分子1的重组载体；所述重组载体2为含有(b1)中所述核酸分子2的重组载体；
39.(b4)重组菌，为重组菌1或重组菌2；所述重组菌1为含有(b1)中所述核酸分子1的重组菌；所述重组菌2为含有(b1)中所述核酸分子2的重组菌；
40.(b5)转基因细胞系，为转基因细胞系1或转基因细胞系2；所述转基因细胞系1为含有(b1)中所述核酸分子1的转基因细胞系；所述转基因细胞系2为含有(b1)中所述核酸分子2的转基因细胞系；
41.(b6)成套核酸分子，由(b1)中所述核酸分子1和所述核酸分子2组成；
42.(b7)成套表达盒，由(b2)中所述表达盒1和所述表达盒2组成；
43.(b8)成套重组载体，由(b3)中所述重组载体1和所述重组载体2组成；
44.(b9)成套重组菌，由(b4)中所述重组菌1和所述重组菌2组成；
45.(b10)成套转基因细胞系，由(b5)中所述转基因细胞系1和所述转基因细胞系2组成。
46.第六方面，本发明要求保护前文第五方面所述生物材料在如下任一中的应用：
47.(c1)制备前文第一方面所述的多肽或成套多肽或前文第二方面所述的偶联物或成套偶联物或前文第三方面所述的试剂盒；
48.(a1)制备检测牛结节性皮肤病病毒抗体的试剂或试剂盒；
49.(a2)制备牛结节性皮肤病病毒诊断抗原。
50.第七方面，本发明要求保护前文第一方面所述的多肽或成套多肽或前文第二方面所述的偶联物或成套偶联物作为免疫原在制备牛结节性皮肤病病毒抗体中的应用。
51.实验证明，用牛结节性皮肤病的全长a27重组蛋白或牛结节性皮肤病的全长a33重组蛋白作为半抗原与载体蛋白偶联得到的偶联物作为包被原，不能有效地区分牛结节性皮肤病抗体和口蹄疫病毒抗体。为了提高牛结节性皮肤病抗体检测的特异性，本发明从牛结节性皮肤病的全长a27和牛结节性皮肤病的全长a33分别选择优势抗原表位ea27和ea33，分别与载体蛋白偶联得到的偶联物(bsa-ea27-1和/或bsa-ea33-1)作为包被原，可以有效地区分牛结节性皮肤病抗体和口蹄疫等多种病毒抗体，提高了牛结节性皮肤病抗体检测的特异性。分别用bsa-ea27-1和/或bsa-ea33-1作为包被抗原制备的检测血清中的牛结节性皮肤病抗体的试剂盒可以将牛结节性皮肤病抗体阳性血清与牛口蹄疫病毒抗体阳性血清、牛病毒性腹泻病毒抗体阳性血清和牛传染性鼻气管炎病毒抗体阳性血清进行准确区分，其对牛结节性皮肤病抗体阳性血清检测的准确性与传统金标准方法病毒中和试验结果一致，敏感性高于病毒中和试验。
52.本发明以bsa-ea27-1和/或bsa-ea33-1作为包被原制备的抗体检测试剂盒特异性强、敏感性高，准确性高，操作简单、快速，适用于基层各级兽医部门和出入境检验检疫局对牛结节性皮肤病感染血清抗体的快速大量筛选检测。
具体实施方式
53.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
54.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
55.下述实施例中的pet32a(+)为华大基因公司产品。鲁米诺化学发光底物，购自洛阳现代生物技术研究院有限公司；化学发光酶标板，购自美国thermo公司；10％的胎牛血清、细胞培养基与相关细胞培养试剂购自美国gibco公司；具备血清中和效价背景的牛结节性皮肤病病毒抗体阴性与阳性样本血清由中国动物疫病预防控制中心(农业农村部兽医诊断中心)保存(阴性血清采集自健康牛，阳性血清采集自田间临床发病的牛，并使用传统金标准方法病毒中和试验进行了抗体效价鉴定)。化学发光免疫分析仪，型号hexu，购自洛阳现
代生物技术有限公司。
56.下述实施例中的牛结节性皮肤病病毒病毒中和试验方法如下：
57.(1)被检血清处理
58.血清于58℃灭活30分钟，用无血清的mem培养基进行梯度稀释备用。
59.(2)对照血清
60.使用具备血清中和效价背景的抗牛结节性皮肤病病毒标准阴性血清和抗牛结节性皮肤病病毒标准阳性血清，由中国动物疫病预防控制中心(农业农村部兽医诊断中心)保存。
61.(3)病毒中和
62.将浓度为2
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105个/ml的vero细胞悬液接种到96孔细胞板上，100μl/孔。37℃5％ co2温箱中培养1-2日，直到有70％-80％的细胞形成单层。将50μl已经稀释好的待检血清与含100tcid50/50μl的牛结节性皮肤病新疆分离株lsdv/xinjiang/2019株(记载于“我国首个lsdv分离株p32、gpcr和rpo30基因克隆及其遗传演化关系与蛋白结构分析，兰州大学，学位论文，doi：10.27204/d.cnki.glzhu.2020.001024”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用，不得他用)悬液等体积混合，置37℃5％ co2温箱中作用1小时。
63.(4)培养
64.血清和病毒中和1小时后，细胞培养板的中和孔，每孔加100μl病毒与血清的混合悬液，37℃5％ co2温箱中继续培养。
65.(5)结果判定
66.接种后72小时进行结果初判，弃掉有特异性病变的孔，并把其他孔的培养液换成维持液，并继续旋转培养7天，进行终判。
67.判定标准：能抑制50％或者50％以上的细胞出现细胞病变效应(cpe)者判为阳性。根据此标准计算血清的最大中和稀释倍数。
68.下述实施例中的牛结节性皮肤病病毒抗体阳性血清经病毒中和试验检测为阳性的血清，牛结节性皮肤病病毒抗体阴性血清经病毒中和试验检测为阴性的血清。
69.实施例1、化学发光免疫分析检测牛结节性皮肤病感染血清抗体
70.本发明人在研发过程中利用pet32a(+)在大肠杆菌bl21(de3)中可溶性表达了牛结节性皮肤病病毒的全长a27蛋白和牛结节性皮肤病病毒的全长a33重组蛋白。实验结果表明将牛结节性皮肤病病毒的全长a27蛋白和牛结节性皮肤病病毒的全长a33重组蛋白分别作为包被抗原建立的化学发光免疫分析方法不能有效地区分牛结节性皮肤病抗体和口蹄疫病毒抗体，特异性差。本发明进一步从牛结节性皮肤病病毒的全长a27蛋白中选择了4个优势抗原表位多肽(ea27-1、ea27-2、ea27-3和ea27-4)，从牛结节性皮肤病病毒的全长a33蛋白中选择了4个优势抗原表位多肽(ea33-1、ea33-2、ea33-3、ea33-4)，分别与bsa偶联后作为包被抗原建立的化学发光免疫分析方法，特异性得到了显著提高，可以有效区分牛结节性皮肤病抗体和口蹄疫病毒抗体，但是敏感性差异较大。将ea27-1与bsa的偶联物(bsa-ea27-1)和ea33-1与bsa的偶联物(bsa-ea33-1)按照1：1的质量比混合得到的混合完全抗原作为包被抗原建立的化学发光免疫分析方法，特异性得到了显著提高，可以有效区分牛结节性皮肤病抗体和口蹄疫病毒抗体，敏感性也显著提高。具体的实验方法如下：
71.一、包括抗原的制备
72.本实施例制备了以下11种包被抗原：
73.(1)bsa-ea27-1+bsa-ea33-1，
74.(2)bsa-ea27-1(ea27-1偶联物)，
75.(3)bsa-ea33-1(ea33-1偶联物)，
76.(4)bsa-ea27-2(ea27-2偶联物)，
77.(5)bsa-ea33-2(ea33-2偶联物)，
78.(6)bsa-ea27-3(ea27-3偶联物)，
79.(7)bsa-ea33-3(ea33-2偶联物)，
80.(8)bsa-ea27-4(ea27-4偶联物)，
81.(9)bsa-ea33-4(ea33-4偶联物)，
82.(10)牛结节性皮肤病病毒的全长a27蛋白，
83.(11)牛结节性皮肤病病毒的全长a33重组蛋白。
84.1、优势抗原表位多肽
85.从牛结节性皮肤病病毒的a27蛋白和a33蛋白中选择优势抗原表位多肽，由北京六合华大基因科技有限公司合成c末端或n末端连接有半胱氨酸的多肽ea27-1、ea27-2、ea27-3、ea27-4、ea33-1、ea33-2、ea33-3、ea33-4(表1)。纯度大于95％，冻干保存。
86.表1、多肽
[0087][0088][0089]
注：序列中的c*为半胱氨酸残基，是为了与载体蛋白连接，在牛结节性皮肤病病毒
的a27蛋白的抗原表位多肽或a33蛋白的抗原表位多肽的氨基末端添加的连接臂；其它氨基酸残基来源于牛结节性皮肤病病毒的a27蛋白或a33蛋白。
[0090]
2、11种包被抗原的制备
[0091]
将ea27-1、ea27-2、ea27-3、ea27-4、ea33-1、ea33-2、ea33-3、ea33-4与ea27-全长、ea33-全长这10种多肽分别与bsa偶联得到10种包被抗原：(1)bsa-ea27-1(ea27-1与bsa的偶联物)，(2)bsa-ea33-1(ea33-1与bsa的偶联物)，(3)bsa-ea27-2(ea27-2与bsa的偶联物)，(4)bsa-ea33-2(ea33-2与bsa的偶联物)，(5)bsa-ea27-3(ea27-3与bsa的偶联物)，(6)bsa-ea33-3(ea33-3与bsa的偶联物)，(7)bsa-ea27-4(ea27-3与bsa的偶联物)，(8)bsa-ea33-4(ea33-4与bsa的偶联物)，(9)bsa-ea27-全长(ea27-全长与bsa的偶联物)，(10)bsa-ea33-全长(ea33-全长与bsa的偶联物)。
[0092]
将bsa-ea27-1(ea27-1与bsa的偶联物)和bsa-ea33-1(ea33-1与bsa的偶联物)按照1：1的质量比混合得到的包被抗原(11)bsa-ea27-1+bsa-ea33-1。
[0093]
其中，包被抗原(1)-(8)以及(11)具体制备方法如下：使用美国kpl公司生产的bsa标签偶联试剂盒(readilink
tm bsa conjugation kit)货号：5501，批号：148045，按照说明书要求对合成的多肽片段进行偶联，制备成包被抗原。
[0094]
包被抗原(9)和(10)具体制备方法如下：
[0095]
使用表达的牛结节性皮肤病病毒的全长a27蛋白和牛结节性皮肤病病毒的全长a33重组蛋白作为包被抗原。
[0096]
第一步：全长a27蛋白基因和全长a33蛋白基因重组表达载体的构建
[0097]
用核苷酸序列是genbank accession no.mn901872.1，(update date是28-oct-2020)的第1-388位替换pet32a(+)的bamh i和xhoi识别位点间的片段(bamh i识别位点和xhoi识别位点间的小片段)，保持pet32a(+)的其它序列不变，得到牛结节性皮肤病病毒的全长a27蛋白基因重组表达载体，命名为pet32a-fla27。pet32a-fla27能表达含有牛结节性皮肤病病毒的全长a27蛋白(氨基酸序列是genbank accession no.mn901872.1，update date是28-oct-2020的第1-129，即seq id no.9)的融合蛋白。
[0098]
用核苷酸序列是genbank accession no.nc_003027.1的第113441-114031位(update date是20-dec-2020)的第1-588位替换pet32a(+)的bamh i和xhoi识别位点间的片段(bamh i识别位点和xhoi识别位点间的小片段)，保持pet32a(+)的其它序列不变，得到牛结节性皮肤病病毒的全长a33蛋白基因重组表达载体，命名为pet32a-fla33。pet32a-fla33能表达含有牛结节性皮肤病病毒的全长a33蛋白(氨基酸序列是genbank accession no.np_150556.1，update date是20-dec-2020的第1-196位，即seq id no.10)的融合蛋白。
[0099]
第二步：重组菌株的构建
[0100]
将第一步构建的pet32a-fla27和pet32a-fla33这两种表达载体分别单独转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞。将其均匀涂布于含氨苄青霉素(50μg/ml)的lb平板上，37℃培养16小时。单菌落振荡培养过夜，提取质粒进行测序，将测序结果表明含有pet32a-fla27的重组大肠杆菌命名为bl21(de3)/pet32a-fla27，将测序结果表明含有pet32a-fla33的重组大肠杆菌命名为bl21(de3)/pet32a-fla33。
[0101]
第三步：牛结节性皮肤病病毒的全长a27蛋白或牛结节性皮肤病髌骨的全长a33重组蛋白的可溶性表达与纯化
[0102]
将bl21(de3)/pet32a-fla27和bl21(de3)/pet32a-fla33这两个菌株分别单独接种于含50μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基(在lb液体培养基中加入氨苄青霉素至氨苄青霉素的浓度为50μg/ml得到的培养基)中，37℃，采用thermo max q6000型全温振荡器200rpm振荡培养至0d
600
值(以含50μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基为空白对照)达到0.6时，加入iptg进行诱导表达。该诱导表达用0.75mm的iptg在16℃诱导13h。取iptg诱导表达13h后的发酵液收集菌体沉淀。加入pbs重悬沉淀，8000rpm/min离心5min，弃掉上清液。向洗涤好的菌体沉淀中加入pbs，高压破碎菌体，裂解至菌液不再粘稠，于4℃离心机中16000rpm/min离心30min，收集上清液，弃沉淀。将上清液用0.22μm滤膜过滤后上样至预先用溶液1(溶质及其浓度如下：20mm tris、150mm nacl，溶剂是水，ph8.0的溶液)平衡好的镍柱。将镍柱接入akta机器上，分别用10个柱体积的溶液1与10个柱体积的溶液2(溶质及其浓度如下：20mm tris、150mm nacl、50mm咪唑，溶剂是水，ph8.0的溶液)清洗镍柱中的杂质蛋白，并在akta机器上监测蛋白峰。用溶液3(溶质及其浓度如下：20mm tris、150mm nacl、300mm咪唑，溶剂是水，ph8.0的溶液)冲洗镍柱挂在镍柱上的目的蛋白，并使用akta收集出现目的蛋白峰的洗脱样品，用ge公司生产的superdex200凝胶柱通过分子筛进一步纯化，分别得到分子筛纯化的牛结节性皮肤病病毒的全长a27蛋白和牛结节性皮肤病病毒的全长a33重组蛋白。
[0103]
二、利用诊断牛结节性皮肤病病毒的化学发光免疫分析试剂盒或检测牛结节性皮肤病病毒抗体的化学发光免疫分析试剂盒进行化学发光免疫分析
[0104]
本实施例提供了11种诊断牛结节性皮肤病病毒的化学发光免疫分析试剂盒或检测牛结节性皮肤病病毒抗体的化学发光免疫分析试剂盒。这11种试剂盒均包括包被抗原、辣根过氧化物酶(hrp)标记牛二抗(货号hm390，禾旭(郑州)生物技术有限公司)、包被缓冲液(货号hc210，禾旭(郑州)生物技术有限公司)、洗涤液(货号hx221，禾旭(郑州)生物技术有限公司)、二抗稀释液(货号hm391，禾旭(郑州)生物技术有限公司)。这11种试剂盒的区别仅在于包被抗原不同，其它组分完全相同。
[0105]
这11种试剂盒分别为包被抗原为步骤一的bsa-ea27-1+bsa-ea33-1的诊断牛结节性皮肤病病毒的化学发光免疫分析试剂盒或检测牛结节性皮肤病病毒抗体的化学发光免疫分析试剂盒，以下简称本发明的试剂盒1；包被抗原为步骤一的bsa-ea27-1的诊断牛结节性皮肤病病毒的化学发光免疫分析试剂盒或检测牛结节性皮肤病病毒抗体的化学发光免疫分析试剂盒，以下简称本发明的试剂盒2；包被抗原为步骤一的bsa-ea33-1的诊断牛结节性皮肤病病毒的化学发光免疫分析试剂盒或检测牛结节性皮肤病病毒抗体的化学发光免疫分析试剂盒，以下简称本发明的试剂盒3。包被抗原为步骤一的bsa-ea27-2的诊断牛结节性皮肤病病毒的化学发光免疫分析试剂盒或检测牛结节性皮肤病病毒抗体的化学发光免疫分析试剂盒，以下简称对照试剂盒1；包被抗原为步骤一的bsa-ea33-2的诊断牛结节性皮肤病病毒的化学发光免疫分析试剂盒或检测牛结节性皮肤病病毒抗体的化学发光免疫分析试剂盒，以下简称对照试剂盒2；包被抗原为步骤一的bsa-ea27-3的诊断牛结节性皮肤病病毒的化学发光免疫分析试剂盒或检测牛结节性皮肤病病毒抗体的化学发光免疫分析试剂盒，以下简称对照试剂盒3；包被抗原为步骤一的bsa-ea33-3的诊断牛结节性皮肤病病毒的化学发光免疫分析试剂盒或检测牛结节性皮肤病病毒抗体的化学发光免疫分析试剂盒，以下简称对照试剂盒4；包被抗原为步骤一的bsa-ea27-4的诊断牛结节性皮肤病病毒的化
学发光免疫分析试剂盒或检测牛结节性皮肤病病毒抗体的化学发光免疫分析试剂盒，以下简称对照试剂盒5；包被抗原为步骤一的bsa-ea33-4的诊断牛结节性皮肤病病毒的化学发光免疫分析试剂盒或检测牛结节性皮肤病病毒抗体的化学发光免疫分析试剂盒，以下简称对照试剂盒6；包被抗原为步骤一的牛结节性皮肤病病毒的全长a27蛋白的诊断牛结节性皮肤病病毒的化学发光免疫分析试剂盒或检测牛结节性皮肤病病毒抗体的化学发光免疫分析试剂盒，以下简称对照试剂盒7；包被抗原为步骤一的牛结节性皮肤病病毒的全长a33蛋白的诊断牛结节性皮肤病病毒的化学发光免疫分析试剂盒或检测牛结节性皮肤病病毒抗体的化学发光免疫分析试剂盒，以下简称对照试剂盒8。
[0106]
(一)利用本发明的试剂盒1，经过优化实验建立了以bsa-ea27-1+bsa-ea33-1为包被抗原的化学发光免疫分析方法(以下简称本发明clia方法1)，包被抗原、辣根过氧化物酶(hrp)标记二抗、二抗稀释液。
[0107]
1、操作步骤
[0108]
(1)包被：用包被缓冲液稀释步骤一中的bsa-ea27-1+bsa-ea33-1的浓度(bsa-ea27-1和bsa-ea33-1的总质量浓度)为1.0μg/ml，得到包被抗原溶液，用该包被缓冲液包被实验孔，100μl/孔加至酶标板，4℃孵育16h。
[0109]
(2)洗涤：倾去孔内包被原溶液，用洗涤液洗涤5次，每次3min；拍干。
[0110]
(3)封闭：加入1％bsa封闭液，350μl/孔，37℃孵育2h。
[0111]
(4)洗涤：同步骤(2)。
[0112]
(5)加样：在血清稀释板中，用样品稀释液(1
×
pbst)将待检样品按照1﹕20比例进行稀释；取出包被板，每次实验需设置系列校准品6孔。首先在血清稀释板上依次加入校准品1～6各100μl，其余各孔依次加入稀释后的待检样品各100μl，置37℃恒温培养箱中温育30min(
±
1min)。
[0113]
(6)洗涤：同步骤(2)。
[0114]
(7)向以上各孔均加入二抗稀释液稀释后的辣根过氧化物酶(hrp)标记二抗100μl，震荡混匀。每孔吸取100μl转移至包被板对应孔内；置37℃恒温培养箱中温育30min(
±
1min)。
[0115]
(8)洗涤：同步骤(2)。
[0116]
(9)加入鲁米诺化学发光底物：每孔各加入100μl的鲁米诺化学发光底物，振荡混匀；在15℃～25℃条件下避光静置5min，静置后15min内用化学发光仪读取发光值。
[0117]
2、结果计算方法
[0118]
ncu(national clinical unit)即国家临床单位，是由国家临检中心制定的单位，在本方法中引用该单位对标准阳性血清(中和抗体效价为1∶512)赋值为20000ncu/ml，以不同稀释倍数的标准阳性血清建立四参数法校准曲线，由检测样品的发光值和校准曲线换算样品的抗体剂量值(ncu/ml)，从而实现半定量检测。
[0119]
将具备血清中和效价背景的牛结节性皮肤病病毒抗体阳性血清按照病毒中和试验结果设定校准品1-6，对应的抗体剂量值(0ncu/ml、10ncu/ml、20ncu/ml、50ncu/ml、100ncu/ml、200ncu/ml)。以校准品1至校准品6的发光值为纵坐标，以对应的抗体剂量值为横坐标，通过elisacalc软件绘制校准品的四参数拟合曲线，四参数模式为y＝(a-b)/[1+(x/c)*b]+d。其中，a为曲线上渐近线估值；b为曲线的斜率；c为最大结合一半时对应的剂
量；d为曲线下渐近线估值。
[0120]
将样本的发光值代入校准曲线计算，即可得出样品中牛结节性皮肤病病毒抗体的含量。
[0121]
3、试验成立条件与结果判定
[0122]
将6个校准品的发光值与对应抗体剂量值进行四参数拟合，r2≥0.99，试验成立。否则，试验不成立。
[0123]
4、阴阳性临界值的确定
[0124]
将200份牛结节性皮肤病病毒抗体阴性血清采用上述方法进行clia检测，计算该200份牛结节性皮肤病病毒抗体阴性血清的剂量值的平均值(x)和标准偏差(sd)。200份牛结节性皮肤病抗体阴性血清的平均剂量值x为28.59，sd为3.64，因此阴阳性临界剂量值为39.51ncu/ml。即剂量值≥39.51ncu/ml判为阳性；剂量值＜39.51ncu/ml判为阴性。
[0125]
(二)利用本发明的试剂盒2，经过优化实验建立了以bsa-ea27-1为包被抗原的化学发光免疫分析方法(以下简称本发明clia方法2)步骤同(一)。
[0126]
(三)利用本发明的试剂盒3，经过优化实验建立了以bsa-ea33-1为包被抗原的化学发光免疫分析方法(以下简称本发明clia方法3)步骤同(一)。
[0127]
(四)利用本发明的对照试剂盒1，经过优化实验建立了以bsa-ea27-2为包被抗原的化学发光免疫分析方法(以下简称对照clia方法1)步骤同(一)。
[0128]
(五)利用本发明的对照试剂盒2，经过优化实验建立了以bsa-ea33-2为包被抗原的化学发光免疫分析方法(以下简称对照clia方法2)步骤同(一)。
[0129]
(六)利用本发明的对照试剂盒3，经过优化实验建立了以bsa-ea27-3为包被抗原的化学发光免疫分析方法(以下简称对照clia方法3)步骤同(一)。
[0130]
(七)利用本发明的对照试剂盒4，经过优化实验建立了以bsa-ea33-3为包被抗原的化学发光免疫分析方法(以下简称对照clia方法4)步骤同(一)。
[0131]
(八)利用本发明的对照试剂盒5，经过优化实验建立了以bsa-ea27-4为包被抗原的化学发光免疫分析方法(以下简称对照clia方法5)步骤同(一)。
[0132]
(九)利用本发明的对照试剂盒6，经过优化实验建立了以bsa-ea33-4为包被抗原的化学发光免疫分析方法(以下简称对照clia方法6)步骤同(一)。
[0133]
(十)利用本发明的对照试剂盒7，经过优化实验建立了以全长a27蛋白为包被抗原的化学发光免疫分析方法(以下简称对照clia方法7)步骤同(一)。
[0134]
(十一)利用本发明的对照试剂盒8，经过优化实验建立了以全长a33蛋白为包被抗原的化学发光免疫分析方法(以下简称对照clia方法8)步骤同(一)。
[0135]
三、特异性试验
[0136]
利用步骤二的本发明clia方法1-3、对照clia方法1-8与牛口蹄疫病毒抗体阳性血清、牛病毒性腹泻病毒抗体阳性血清和牛传染性鼻气管炎病毒抗体阳性血清(各种阳性血清均采集自临床发病动物的血清)进行比对，观察与其它同种属疾病有无交叉反应。另外，同时通过病毒中和试验进行检测(具体方法参见前文)。
[0137]
结果显示：本发明clia方法1-3以及对照clia方法1-8的检测结果，抗体剂量值均小于40ncu/ml,判定为阴性。特异性为100％。病毒中和试验的中和指数均小于1：5这一国家
标准,结果均为阴性。具体结果参加表1和表2。
[0138]
表1、本发明方法1-3与病毒中和试验特异性试验结果
[0139][0140]
表2、对照方法1-8特异性试验结果
[0141][0142][0143]
四、灵敏度试验
[0144]
将牛结节性皮肤病病毒抗体阳性血清进行倍比稀释，分别采用本发明clia方法1-3和已知血清中和效价背景的血清样本进行比对检测，得出阳性临界值时的最大稀释度。结果表明本发明clia方法1-3检测阳性血清的最高稀释倍数均为1:1024倍。病毒中和试验结果检测阳性血清的最高稀释倍数为1:512。见表3。
[0145]
表3、本发明clia方法1-3与中和试验灵敏度结果
[0146][0147]
五、重复性试验
[0148]
采用本发明方法1-3分别对10份牛结节性皮肤病病毒抗体阳性血清在同批次板和不同批次板上分别进行检测，平行测定5次，计算批内、批间变异系数(cv)。结果显示，本发明clia方法1-3批内重复变异系数在8％以内，批间重复变异系数小于10％(表4至表6)。结果表明，牛结节性皮肤病病毒抗体阳性血清具有良好的重复性。
[0149]
表4、本发明clia方法1重复性试验
[0150][0151]
表5、本发明clia方法2重复性试验
[0152][0153]
表6、本发明clia方法3重复性试验
[0154][0155][0156]
六、符合性试验
[0157]
采用中国动物疫病预防控制中心(农业农村部兽医诊断中心)保存的牛血清，挑选出了血清中和效价背景为牛结节性皮肤病病毒抗体阳性的80份牛血清与血清中和效价背景为牛结节性皮肤病病毒抗体阴性的80份牛血清。对这160份牛血清分别采用本发明clia方法1-3、对照clia方法1-8进行检测，计算其与中和试验方法的符合率。
[0158]
结果表明该160份牛血清，本发明clia方法1与中和试验方法的总符合率为98.75％(阳性符合率为100％，阴性符合率为97.5％)，本发明clia方法2与牛结节性皮肤病病毒中和试验方法的总符合率为95.625％(阳性符合率为93.75％，阴性符合率为97.5％)，本发明clia方法3与牛结节性皮肤病病毒中和试验方法的总符合率为96.25％(阳性符合率为92.5％，阴性符合率为100％)。本发明对照clia方法1检测结果与牛结节性皮肤病病毒中和试验方法的总符合率为85.625％(阳性符合率为85％，阴性符合率为86.25％)，本发明对照clia方法2检测结果与牛结节性皮肤病病毒中和试验方法的总符合率为78.125％(阳性符合率为81.25％，阴性符合率为75％)，本发明对照clia方法3检测结果与牛结节性皮肤病病毒中和试验方法的总符合率为75.625％(阳性符合率为80％，阴性符合率为71.25％)，本发明对照clia方法4检测结果与牛结节性皮肤病病毒中和试验方法的总符合率为78.125％
(阳性符合率为100％，阴性符合率为56.25％)，本发明对照clia方法5检测结果与牛结节性皮肤病病毒中和试验方法的总符合率为79.375％(阳性符合率为80％，阴性符合率为78.75％)，本发明对照clia方法6检测结果与牛结节性皮肤病病毒中和试验方法的总符合率为81.25％(阳性符合率为88.75％，阴性符合率为73.75％)，本发明对照clia方法7检测结果与牛结节性皮肤病病毒中和试验方法的总符合率为85.625％(阳性符合率为100％，阴性符合率为71.25％)，本发明对照clia方法8检测结果与牛结节性皮肤病病毒中和试验方法的总符合率为85.625％(阳性符合率为97.5％，阴性符合率为73.75％)。具体参见表7至表16。
[0159]
以上结果说明分别将bsa-ea27-1+bsa-ea33-1、bsa-ea27-1和bsa-ea33-1作为包被抗原制备的诊断牛结节性皮肤病病毒抗体化学发光免疫分析试剂盒或检测牛结节性皮肤病病毒抗体的化学发光免疫分析试剂盒与中和试验方法的总符合率显著高于分别以bsa-ea27-2、bsa-ea27-3、bsa-ea27-4、bsa-ea33-2、bsa-ea33-3、bsa-ea33-4、牛结节性皮肤病病毒的全长a27蛋白和牛结节性皮肤病病毒的全长a33蛋白作为包被抗原制备的诊断牛结节性皮肤病病毒抗体的化学发光免疫分析试剂盒或检测牛结节性皮肤病病毒抗体的化学发光免疫分析试剂盒。
[0160]
表7、本发明clia方法1对牛血清样品检测结果
[0161][0162]
表8、本发明clia方法2对牛血清样品检测结果
[0163][0164]
表9、本发明clia方法3对牛血清样品检测结果
[0165][0166]
表10、对照clia方法1对牛血清样品检测结果
[0167][0168][0169]
表11、对照clia方法2对牛血清样品检测结果
[0170][0171]
表12、对照clia方法3对牛血清样品检测结果
[0172][0173]
表13、对照clia方法4对牛血清样品检测结果
[0174][0175]
表14、对照clia方法5对牛血清样品检测结果
[0176][0177][0178]
表15、对照clia方法6对牛血清样品检测结果
[0179][0180]
表16、对照clia方法7对牛血清样品检测结果
[0181][0182]
表17、对照clia方法8对牛血清样品检测结果
[0183][0184]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。