水稻RSB11基因在抗纹枯病中的应用

水稻rsb11基因在抗纹枯病中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及水稻rsb11基因在抗纹枯病中的应用。


背景技术：

2.纹枯病是我国水稻最主要的病害之一，其致病真菌是立枯丝核菌(rhizoctoniasolanik
ü
hn)，近年来，随着秸秆还田、高密栽插、无人机植保等栽培管理技术的大力推广，田间病原菌基数不断累积，纹枯病的发生与危害日趋加重，每年带来10％-30％的产量损失，严重时高达50％，其发生面积和造成的产量损失一直位于水稻各病害之首，严重威胁水稻的生产安全。利用抗病基因培育抗病水稻品种是最经济有效的控制病害的措施。不同水稻品种对纹枯病的抗性有明显的差异，然而，目前还没有发现完全抗纹枯病的水稻品种或种质，抗性品种也严重缺乏。
3.水稻对纹枯病的抗性是典型数量性状，受数量性状位点(qtl)或多基因控制，至今已经鉴定到60多个水稻抗纹枯病qtl，然而，由于遗传分离群体中不同个体的表型难以准确鉴定，通过传统的图位克隆方法还没有成功克隆抗纹枯病qtl的报道，且只有少数qtl被证明有育种应用价值，严重制约了抗纹枯病的分子机制解析和育种进程。此外，通过反向遗传学和各种组学策略，发现植物已知防御系统中的许多基因或信号通路参与了纹枯病抗性的调控，如激素(水杨酸、茉莉酮和乙烯)相关基因、病程相关蛋白、糖转运蛋白、转录因子和叶绿素降解蛋白等编码基因。这些进展大大加深了我们对水稻和纹枯病菌之间相互作用机制的理解，然而，这些基因中的大多数通常需要在生长和发育过程中进行精确调控，当它们被过度激活或持续抑制时，虽然抗病性得到了增强，但生长发育往往受到影响，因此，它们在育种中的应用价值还有待进一步研究。
4.近年来，随着高通量基因分型技术的发展，基于连锁不平衡(linkage disequilibrium，ld)的全基因组关联分析(genome-wide association study，gwas)在挖掘作物复杂数量性状qtl/基因方面显示出巨大优势。与传统的图位克隆方法相比，gwas可以识别更接近候选基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，snp)标记位点，并在自然品种中挖掘目标性状的有利等位变异。对于纹枯病抗性，chen等利用299个不同的水稻品种，通过gwas鉴定了11个与纹枯病抗性显著相关的snp位点。zhang等利用3k水稻基因组计划中的563个水稻品种，通过gwas检测到27个与纹枯病抗性显著相关的位点。li等通过gwas在玉米中克隆了一个能赋予纹枯病抗性的优异等位变异zmfbl41b73，发现该基因主要通过增加细胞壁中的木质素含量来增强抗性，这种机制也有利于增强水稻对纹枯病的抗性。最近，wang等对259个不同的水稻品种进行了gwas研究，证明了两个基因osrsr1和osrlck5通过调节ros平衡来提高纹枯病抗性。这些研究表明，gwas的应用有望大大加快自然水稻品种中抗纹枯病优异等位变异的鉴定和抗病机制的研究进程。然而，这些克隆的抗纹枯病基因的应用价值还未在育种实践中得以证实，且远远不能满足育种的需要。
5.总体而言，目前在水稻抗病育种中，可利用的抗纹枯病基因资源非常缺乏。因此，进一步挖掘和克隆有育种利用价值的抗纹枯病数量基因将为水稻抗纹枯病分子育种提供
重要基因资源。


技术实现要素：

6.第一方面，本发明要求保护rsb11蛋白或其相关生物材料在如下任一中的应用：
7.p1、调控植物纹枯病抗性；
8.p2、调控植物对立枯丝核菌(rhizoctoniasolanik
ü
hn)抗性。
9.其中，所述相关生物材料可为能够表达所述rsb11蛋白的核酸分子，或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。
10.所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达rsb11的dna，该dna不但可包括启动rsb11基因转录的启动子，还可包括终止rsb11转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：泛生素基因ubiqutin启动子(pubi)；花椰菜花叶病毒的组成型启动子35s；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("lap",chao等人(1999)plant physiol 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(pr1)(由水杨酸和bth(苯并噻二唑-7-硫代羟酸s-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂ii启动子(pin2)或lap启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pf128(cn101063139b(中国专利2007 1 0099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(beachy等人(1985)embo j.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(nos终止子)、花椰菜花叶病毒camv 35s终止子、tml终止子、豌豆rbcs e9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：odell等人(i985)nature 313:810；rosenberg等人(1987)gene,56:125；guerineau等人(1991)mol.gen.genet,262:141；proudfoot(1991)cell,64:671；sanfacon等人genes dev.,5:141；mogen等人(1990)plant cell,2:1261；munroe等人(1990)gene,91:151；ballad等人(1989)nucleic acids res.17:7891；joshi等人(1987)nucleic acid res.,15:9627)。
11.构建含有所述rsb11基因表达盒的重组表达载体。所利用的植物表达载体可为双元农杆菌载体或gateway系统载体等，如pbin438、pcambia1302、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pbi121、pgwb411、pgwb412、pgwb405、pcambia1391-xa或pcambia1391-xb。使用rsb11构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、泛素基因ubiqutin启动子(pubi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
12.为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(gus基因、
萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。
13.上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
14.上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中细菌可来自埃希氏菌属(escherichia)，欧文氏菌(erwinia)，根癌农杆菌属(agrobacterium)(如根癌农杆菌eha105)，黄杆菌属(flavobacterium)，产碱菌属(alcaligenes)，假单胞菌属(pseudomonas)，芽胞杆菌属(bacillus)等。
15.所述rsb11蛋白可为如下任一：
16.(a1)氨基酸序列为seq id no.1的蛋白质；
17.(a2)将seq id no.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且来源于水稻具有相同功能的蛋白质；
18.(a3)与(a1)-(a2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且来源于水稻具有相同功能的蛋白质；
19.(a4)在(a1)-(a3)中任一所限定的蛋白质的n端和/或c端连接蛋白标签后得到的融合蛋白，
20.上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。
21.上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
22.上述蛋白质中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。。
23.在所述植物中，所述rsb11蛋白的表达量和/或活性升高，所述植物对纹枯病的抗性增强和/或对立枯丝核菌(rhizoctonia solani k
ü
hn)的抗性增强。同时可以减少植物产量损失。
24.在所述植物中，所述rsb11蛋白的表达量和/或活性降低，所述植物对纹枯病的抗性增强和/或对立枯丝核菌(rhizoctonia solani k
ü
hn)的抗性减弱。
25.第二方面，本发明要求保护如下任一方法：
26.q1：一种培育对纹枯病抗性增强和/或对立枯丝核菌(rhizoctonia solani k
ü
hn)抗性增强的植物的方法，包括使受体植物中rsb11蛋白的表达量和/或活性升高的步骤。
27.所述方法可以通过杂交手段实现，也可以通过转基因手段实现。所述方法同时可以减少植物产量损失。
28.q2：一种培育对纹枯病抗性减弱和/或对立枯丝核菌(rhizoctonia solani k
ü
hn)
抗性减弱的植物的方法，包括使受体植物中rsb11蛋白的表达量和/或活性降低的步骤。
29.所述方法可以通过杂交手段实现，也可以通过转基因手段实现。
30.q3：一种培育对纹枯病抗性增强和/或对立枯丝核菌(rhizoctonia solani k
ü
hn)抗性增强的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达rsb11蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对纹枯病抗性增强和/或对立枯丝核菌(rhizoctonia solani k
ü
hn)抗性增强。
31.在所述方法中，向所述受体植物中导入能够表达所述rsb11蛋白的核酸分子可通过任何能够实现这一目的的技术手段实现。如向所述目的植物中导入前文第一方面中所述的重组载体。
32.在本发明的一个实施案例中，所述重组载体具体为将能够表达所述rsb11蛋白的核酸分子克隆到pcambia2300载体后得到的重组质粒。在所述重组质粒中启动能够表达所述rsb11蛋白的核酸分子转录的启动子为rsb11-r启动子(即seq id no.4所示dna分子)(对应实施例中的互补载体)或者ubi启动子(对应实施例中的过表达载体)。
33.所述方法可以同时减少植物产量损失。
34.q4：一种培育对纹枯病抗性减弱和/或对立枯丝核菌(rhizoctonia solani k
ü
hn)抗性减弱的转基因植物的方法，包括如下步骤：对受体植物中能够表达rsb11蛋白的核酸分子进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对纹枯病抗性减弱和/或对立枯丝核菌(rhizoctonia solani k
ü
hn)抗性减弱。
35.在所述方法中，对所述受体植物中能够表达所述rsb11蛋白的核酸分子进行抑制表达可通过任何能够实现这一目的的技术手段实现。
36.在本发明的一个实施案例中，具体是通过crispr/cas9技术实现的。进一步地，靶向rsb11基因的特异性间隔序列为ataccctcgcggtggggc。
37.所述rsb11蛋白可为前文(a1)-(a4)中任一所示蛋白质。
38.在上述方法中，所述重组载体导入所述受体植物，具体可为：通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
39.上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含第一代到第二代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
40.在上述各方面中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna等。
41.在上述各方面中，能够表达所述rsb11蛋白的核酸分子可为如下任一：
42.(b1)seq id no.2或seq id no.3所示的dna分子；
43.(b2)在严格条件下与(b1)限定的dna分子杂交且编码所述rsb11蛋白的dna分子；
44.(b3)与(b1)-(b2)中任一限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述rsb11蛋白的dna分子。
45.上述核酸分子中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(sds)、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，2
×
ssc，0.1％ sds中漂洗；还可为：50
℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，1
×
ssc，0.1％ sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，0.5
×
ssc，0.1％ sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，0.1
×
ssc，0.1％ sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在65℃，0.1
×
ssc，0.1％ sds中漂洗；也可为：在6
×
ssc，0.5％ sds的溶液中，在65℃下杂交，然后用2
×
ssc，0.1％ sds和1
×
ssc，0.1％ sds各洗膜一次。
46.上述核酸分子中，同源性是指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对核苷酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
47.上述核酸分子中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。
48.第三方面，本发明要求保护如下任一生物材料：
49.(i)一种dna分子，其核苷酸序列如seq id no.4所示；
50.(ii)含有(i)中所述dna分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
51.其中，(i)所述dna分子为启动子。
52.第四方面，本发明要求保护一种引物对。
53.本发明要求保护的引物对由seq id no.5和seq id no.6所示两条单链dna分子组成。
54.所述引物对用于扩增水稻基因组中rsb11基因启动子区域含有的与纹枯病抗性相关的一个snp位点的片段。
55.第五方面，本发明要求保护含有前文第四方面所述引物对的试剂盒。
56.所述试剂盒中还可含有限制性内切酶mlui。
57.第六方面，本发明要求保护如下任一应用：
58.m1：前文第三方面中所述dna分子作为启动子在增强植物体内目的基因表达中的应用；
59.进一步地，所述目的基因为能够表达rsb11蛋白的核酸分子。
60.m2：前文第三方面中所述dna分子在如下(a1)-(a2)任一中的应用：
61.(a1)提高植物对纹枯病的抗性；
62.(a2)提高植物对立枯丝核菌(rhizoctonia solani k
ü
hn)的抗性。
63.同时还可以减少植物产量损失。
64.进一步地，在所述应用中，由所述dna分子启动植物体内目的基因表达，所述目的基因为能够表达rsb11蛋白的核酸分子。
65.m3：能够使植物中rsb11蛋白的表达量和/或活性升高的物质在如上(a1)-(a2)任一中的应用。同时还可以减少植物产量损失。
66.m4：能够使植物中rsb11蛋白的表达量和/或活性降低的物质在(b1)-(b2)任一中的应用：
67.(b1)降低植物对纹枯病的抗性；
68.(b2)降低植物对立枯丝核菌(rhizoctonia solani k
ü
hn)的抗性。
69.m5：检测snp94782、indel1171、indel946和snp94780这四个变异位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定水稻对纹枯病抗性中的应用；所述snp94782是水稻基因组的一个snp，对应seq id no.4(rsb11-r启动子序列)的第516位核苷酸，其为t或g；所述indel1171是水稻基因组的一个缺失变异，对应seq id no.4(rsb11-r启动子序列)的第2005-2135位核苷酸(131bp)，为缺失或不缺失；所述indel946是水稻基因组的一个缺失变异，对应seq id no.4(rsb11-r启动子序列)的第2231-2486位核苷酸(256bp)，为缺失或不缺失；所述snp94780是水稻基因组的一个snp，对应seq id no.2或seq id no.3(rsb11基因序列)的第1653位核苷酸，其为a或g。
70.m6：检测单倍型的物质在鉴定或辅助鉴定水稻对纹枯病抗性中的应用；所述单倍型是水稻基因组上m5中所述snp94782、所述indel1171、所述indel946和所述snp94780这四个变异位点的多态性或基因型组合。
71.m7：检测m5中所述snp94782的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定水稻对纹枯病抗性中的应用。
72.m8：前文第四方面所述引物对或前文第五方面所述试剂盒在检测m5中所述snp94782的多态性或基因型中的应用。
73.m9：前文第四方面所述引物对或前文第五方面所述试剂盒在鉴定或辅助鉴定水稻对纹枯病抗性中的应用；
74.m10：前文第三方面中所述dna分子或前文第四方面所述引物对或前文第五方面所述试剂盒在植物育种中的应用。
75.所述rsb11蛋白可为前文(a1)-(a4)中任一所示蛋白质。
76.在上述各方面中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。
77.进一步地，所述单子叶植物可为禾本科植物。
78.更进一步地，所述禾本科植物可为稻属植物。
79.在本发明的具体实施方式中，所述植物为水稻。
80.第七方面，本发明要求保护如下任一方法：
81.q5：一种鉴定或辅助鉴定水稻对纹枯病抗性的方法，包括如下步骤(c1)或(c2)：
82.(c1)检测待测水稻基因组中前文第六方面的m6中所述单倍型，根据所述待测水稻的单倍型按照如下确定所述待测水稻对纹枯病的抗性：单倍型rsb11-r对应的纯合基因型水稻对纹枯病的抗性强于或候选强于单倍型rsb11-s对应的纯合基因型水稻；所述单倍型rsb11-r为：所述snp94782为t且所述indel1171为不缺失且所述indel946为不缺失且所述snp94780为a；所述单倍型rsb11-s为：所述snp94782为g且所述indel1171为缺失且所述indel946为缺失且所述snp94780为g；
83.进一步地，检测所述待测水稻基因组中所述单倍型的方法可为测序。
84.(c2)检测待测水稻基因组中前文第六方面的m5中所述snp94782的基因型，根据所述待测水稻的所述snp94782的基因型按照如下确定所述待测水稻对纹枯病的抗性：所述
snp94782的基因型为tt的水稻对纹枯病的抗性强于或候选强于所述snp94782的基因型为gg的水稻。
85.进一步地，可采用前文第四方面所述引物对或前文第五方面所述试剂盒检测所述待测水稻基因组中所述snp94782的基因型。
86.更进一步地，如果以所述待测水稻基因组dna为模板，采用所述引物对扩增得到大小为154bp的目的片段(如seq id no.7所示，且第28位为纯合t)，则所述待测水稻基因组中所述snp94782的基因型为tt。如果以所述待测水稻基因组dna为模板，采用所述引物对扩增仅得到大小为154bp的目的片段(如seq id no.7所示，且第28位为纯合g)，则所述待测水稻基因组中所述snp94782的基因型为gg。
87.更进一步地，如果以所述待测水稻基因组dna为模板，采用所述引物对扩增后对扩增产物进行mlui完全酶切，酶切产物为154bp，则所述待测水稻基因组中所述snp94782的基因型为tt；如果以所述待测水稻基因组dna为模板，采用所述引物对扩增后对扩增产物进行mlui完全酶切，酶切产物为130bp和24bp，则所述待测水稻基因组中所述snp94782的基因型为gg。
88.q6：一种培育对纹枯病抗性提高的水稻品种的方法，包括如下步骤：选择经q5所述方法鉴定得到的对纹枯病抗性相对较强的水稻品种(所述单倍型为单倍型rsb11-r，或所述snp94782的基因型为tt)作为供体亲本，选择经q5所述方法鉴定得到的对纹枯病抗性相对较弱(如所述单倍型为单倍型rsb11-s，或所述snp94782的基因型为gg)但具有预期农艺性状的水稻品种作为轮回亲本，通过连续回交选育得到对纹枯病抗性提高并且具有所述预期农艺性状的水稻品种。
89.本发明所述培育对纹枯病抗性提高的水稻品种的方法可以是利用杂交、回交并结合标记辅助选择(mas)技术将rsb11的优异自然等位变异rsb11-r导入常规粳稻品种中，获得纹枯病抗性增强的常规水稻新品系。所述方法同时还可以减少水稻产量损失。
90.本发明通过全基因组关联分析克隆的抗纹枯病数量基因rsb11，其编码一个凝集素类受体激酶蛋白。rsb11启动子区中的三个变异增加了其表达水平和纹枯病抗性，从而产生了一个优异自然等位变异rsb11-r。与野生型相比，rsb11基因表达量上升，则纹枯病抗性增强；而rsb11基因敲除后，则纹枯病抗性减弱。将rsb11-r通过分子标记辅助选择转入感病单倍型粳稻品种能改良其纹枯病抗性，不影响基本农艺性状，且在重发病条件下可以挽回9.54％的产量损失，显示rsb11-r在水稻抗病分子育种中具有重要应用价值。本发明的rsb11基因及编码蛋白质对培育抗纹枯病水稻品种、减少水稻产量损失具有重要意义。
附图说明
91.图1是全基因组关联分析鉴定到与水稻纹枯病抗性显著关联基因rsb11。a：纹枯病抗性gwas分析曼哈顿图，箭头表示两个关联最显著snp位点。b：两个最显著关联snp位点ld区间的局部曼哈顿图和区间内基因。c：ld区间内24个基因在湘晚籼7号品种中受纹枯病菌诱导表达情况。d：基于rsb11序列变异的关联分析结果，点表示snp，三角形表示indel。e：根据四个关联最显著位点将rsb11基因分为两种单倍型。n表示每个单倍型的品种数量。条形图表示每个单倍型组的纹枯病病级。f：rsb11-r和rsb11-s品种受纹枯病侵染前后的rsb11表达水平比较。g：水稻原生质体启动子活性的瞬时表达测定。prsb11-s和prsb11-r分别表
示镇稻88和湘晚籼7号品种中rsb11的启动子区。p表示双侧t检验显著性。
92.图2是rsb11t-dna插入突变体rsb11更感纹枯病。a：rsb11中的t-dna插入位点。p1、p2和p3表示用于验证插入位点的引物。rb和lb分别表示t-dna的右边界和左边界。b：rsb11中的rsb11基因被破坏而不表达(电泳图)。c：插入位点的pcr验证。d和e：rsb11和wt之间的田间纹枯病抗性比较。
93.图3是rsb11调控纹枯病抗性的转基因验证。a：rsb11互补系中rsb11的表达水平。b：rsb11过表达系中rsb11的表达水平。c：rsb11互补系的纹枯病抗性。d：rsb11过表达系的纹枯病抗性。e：rsb11敲除系突变位点情况。f：rsb11敲除系的纹枯病抗性。不同大写字母表示p＜0.01水平下的多重比较结果。**表示显著水平p＜0.01。
94.图4是rsb11互补系、过表达系和敲除系的田间纹枯病抗性和主要农艺性状。不同大写字母表示p＜0.01水平下的多重比较结果。a:rsb11互补系和野生型(wt)的田间纹枯病抗性表型。b:rsb11过表达系、敲除系及野生型的田间纹枯病抗性表型。c:rsb11互补系和野生型(wt)的田间主要农艺性状比较。d:rsb11过表达系、敲除系及野生型的田间主要农艺性状比较。n.s.表示没有显著性差异。
95.图5是优异等位变异rsb11-r的标记辅助选择路线图。a：rsb11-r特异性dcaps分子标记dcaps-2697。b：将ysbr1中的rsb11-r导入粳稻品种tg394的mas路线图。
96.图6是rsb11-r显著降低了纹枯病造成的产量损失。a：nil-rsb11-r和tg394的纹枯病抗性。b：nil-rsb11-r和tg394在田间重发病条件下的纹枯病表型。c-l：nil-rsb11-r和tg394在轻发病和重发病条件下的病级(c)、小区产量(d)、结实率(e)、千粒重(f)、有效穗数(g)、每穗粒数(h)、株高(i)、全生育期(j)、垩白粒率(k)和直链淀粉含量(l)。不同大写和小写字母分别表示p＜0.01和p＜0.05水平下的多重比较结果。**表示显著水平p＜0.01。n.s.表示没有显著性差异。
具体实施方式
97.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
98.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
99.实施例1、rsb11基因的鉴定、克隆与功能验证
100.一、材料方法
101.(1)纹枯病抗性鉴定
102.纹枯病抗性鉴定按照前人描述的方法进行(贺闽等人,植物学报，2020，55：577-587)，利用致病性强的纹枯病菌菌株rh-9(zuo等人，theoretical and applied genetics，2013，126:1257-1272)接种水稻。纹枯病菌首先在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上28℃培养3天，然后将真菌块(直径0.7cm左右)转接到含有厚度为0.8mm、长度为1.0cm木皮的马铃薯葡萄糖肉汤培养基上，并在28℃下生长，培养3天左右直到菌丝完全覆盖在木皮上，用菌丝定植的木皮作为接种物。对于田间接种，在分蘖后期将接种物从植株顶部插入倒三鞘内测，每
个植株接种三个主要分蘖。根据“0-9”疾病评分系统(zuo等人，theoretical and applied genetics，2013，126:1257-1272)，在抽穗后30天记录病级，三次重复，每个重复10株，最终计算三次重复的平均病级。对于温室接种，在孕穗早期将植株转移到相对湿度为75％-85％的温室中进行，用与田间接种相同的方法接种每株植物的四个主要分蘖，在接种后14天测量病斑长度，并计算三次重复的平均值。
103.(2)荧光定量pcr
104.使用trizol试剂(invitrogen，carlsbad，ca)从水稻叶鞘中提取总rna。根据试剂的说明书(primescripttm 1st strand cdna synthesis kit，takara)，用1μg纯化的总rna逆转录第一链cdna。使用sybr premix extaqⅱ试剂盒(takara)在cfx96tm荧光定量pcr检测系统(biorad,hercules,ca)上使用基因特异性引物进行荧光定量pcr(定量引物见表1中)。
105.(3)双荧光素酶报告分析
106.用引物psbrr1-luc-f和psbrr1-luc-r(引物见表1)分别从镇稻88(rsb11-s型品种)和湘晚籼7号(rsb11-r型品种)扩增出rsb11的3123bp启动子区域，然后分别克隆到pgreenii 0800-luc载体多克隆位点处，并将renilla荧光素酶基因用作内部对照(hellens等人，plant methods 2005,1,13)。通过peg介导的转化将这两种载体转染到水稻原生质体中(chern等人，plant methods,2012,8,6)。使用双荧光素酶报告物分析系统(promega，e1910)测量荧光素酶活性。计算luc与ren活性的比值以确定相对启动子活性(hellens等人，plant methods 2005,1,13)。设计了六个生物学重复。
107.(4)重组植物表达载体的构建
108.互补载体的构建：用限制性内切酶bglii和ecori对植物双元表达载体pcambia2300进行双酶切，电泳、回收线性载体备用。以携带rsb11-r的抗病单倍型品种湘晚籼7号(xwx7)的基因组dna为模板，用rsb11基因组启动子区扩增引物对2300-prorsb11-f和2300-prorsb11-r(引物序列见表1，已在5’端分别加上bglii和ecori酶切位点和载体重组接头序列)进行pcr扩增，然后将得到的rsb11基因组启动子3123bp片段prsb11
xwx7
(seq id no.4)用重组酶(南京诺维赞)重组进克隆载体pcambia2300，并测序验证，得到重组载体pcambia2300-prsb11
xwx7
。紧接着用smai和bamhi双酶切该重组载体，电泳、回收线性载体备用。以rsb11-s感病单倍型品种dongjin(dj)的基因组dna为模板，dongjin(dj)为本实验室保存(feng等人，journal of experimental botany,2016，67，4241-4253)，用rsb11基因组编码区扩增引物2300-rsb11-f和2300-rsb11-r(引物序列见表1，已在5’端分别加上smai和bamhi酶切位点和载体重组接头序列)进行pcr扩增，然后将得到的rsb11基因组dna编码区2463bp片段cds-rsb11
dj
(seq id no.2)用重组酶(南京诺维赞)重组进克隆载体pcambia2300-prsb11
xwx7
，并测序验证，得到互补重组载体prsb11
xwx7
:crsb11
dj
。
109.过表达载体的构建：用psti单酶切过表达载体pcambia1390，电泳、回收线性载体备用。提取水稻品种dongjin(dj)的植物总mrna，以此为模板合成第一链cdna，按照ncbi网站上预测的rsb11的cds序列设计引物，在前后引物的5
‘
端分别加上载体上的重组接头序列，用设计好的引物对rsb11-1390-f和rsb11-1390-r(引物序列见表1，已在5’端分别加上psti酶切位点和载体重组接头序列)扩增cdna，电泳、回收片段，然后用重组酶(南京诺维赞)将得到的2460bp包含rsb11基因全长cds序列片段(seq id no.2)与酶切好的
pcambia1390线性载体进行重组连接，并测序验证，获得重组载体pubi:crsb11
dj
。
110.基因敲除载体的构建：利用crispr/cas9系统构建rsb11基因敲除载体，首先设计并生成grna靶序列，在rsb11基因的基因组序列上寻找目标序列，将rsb11基因的18bp基因特异性间隔序列(ataccctcgcggtggggc)克隆到中间载体pos-sgrna上(miao等人,cell research,2013,23:1233-1236)，接着利用gateway lr clonase ii酶混合物(上海英俊)将连有基因特异间隔序列的sgrna亚克隆到含cas9表达组件的目标载体pos-cas9上，具体方法参考文献(miao等人,cell research,2013,23:1233-1236)，获得rsb11的基因敲除载体pcas9-rsb11。
111.表1、引物列表
[0112][0113][0114]
注：下划线序列表示载体上序列。
[0115]
二、结果与分析
[0116]
1、rsb11基因的鉴定
[0117]
为了研究水稻对纹枯病的抗性，本发明对来自中国、日本和韩国不同地区的178个水稻推广品种进行重测序和田间纹枯病抗性鉴定，利用gwas鉴定到48个与纹枯病抗性显著关联的snp位点(图1中a)。其中关联性最强的两个snp为11号染色体上的snp94780和snp94782位点，相隔3.9kb，对纹枯病抗性的贡献率达到16.82％，这两个位点位于一个物理距离为191kb的ld区块，该区块包含24个基因(图1中b)，我们发现，在这些基因中，只有基因loc_os11g10290受到纹枯病菌侵染的强烈诱导表达(图1中c)；结合上述两个关联显著性最高的snp也正好分别位于loc_os11g10290的启动子和编码区域内(图1中b)，我们推断这个基因很可能与纹枯病抗性有关，我们将其命名为rsb11(resistance gene tosheath blight on chromosome11)。rsb11基因编码一个凝集素类受体激酶蛋白(lecrlk)，野生型
日本晴中rsb11基因具有seq id no.2所示的核苷酸序列，其编码的蛋白质序列为seq id no.1。
[0118]
我们随后对20个病级大于6.5的感病品种和20个病级小于5.5的相对抗病品种(表2)进行了rsb11基因的测序，测序区间包括3341bp的启动子区、96bp的5
′
非编码区、2463bp的编码区、143bp的3
′
非编码区和3
′
非编码区下游的150bp，利用测序结果和品种病级进一步进行了基于rsb11基因的关联分析，结果表明编码区的一个snp位点(snp94780)和启动子区的三个snp/indel位点(snp94782、indel1171和indel946)与纹枯病抗性最显著相关(图1中d)，其中，snp94782是水稻基因组的一个snp，对应seq id no.4的第515位核苷酸，其为t或g；indel1171是水稻基因组的一个缺失变异，对应seq id no.4的第2005-2135位核苷酸(131bp)，为缺失或不缺失；indel946是水稻基因组的一个缺失变异，对应seq id no.4的第2231-2486位核苷酸(256bp)，为缺失或不缺失；snp94780是水稻基因组的一个snp，对应seq id no.2的第1653位核苷酸，其为a或g。基于这4个变异位点，rsb11等位基因被分为两个单倍型：纹枯病感病单倍型rsb11-s和抗病单倍型rsb11-r(图1中e)，单倍型rsb11-r对应的纯合基因型水稻对纹枯病的抗性强于单倍型rsb11-s对应的纯合基因型水稻；单倍型rsb11-r为：snp94782为t且indel1171为不缺失且indel946为不缺失且snp94780为a；单倍型rsb11-s为：snp94782为g且indel1171为缺失且indel946为缺失且snp94780为g。由于位于编码区的snp94780不会引起氨基酸的变化(snp94782为g的rsb11基因序列如seq id no.3所示，编码seq id no.1所示蛋白)，而其他三个变异位点均位于启动子区，因此这三个变异可能会影响rsb11的表达水平，我们利用rsb11的荧光定量引物qrsb11-f和qrsb11-r(表1)随机检测了20个rsb11-s型(湘晚籼1号、红晚5202、胜利籼44、南花11号、鄂晚5号、扬稻4号、镇稻88、连粳6号、武陵粳1号、早熟香黑米、祥农15号、矮浙九选、窄叶青8、麻包锦、合系41、温广青、窄二稻、油六稻、铁9868、南原稻)和12个rsb11-r型(扬稻3号、嘉禾218、桂朝2号、南特号、黄丝桂占、湘矮早3号、湘州7号、华中1号、特三矮2号、粤桂146、湘晚籼7号、四青晚籼)品种在接种纹枯病菌rh-9前后的rsb11表达水平。我们发现在接种前rsb11-r的表达水平高于rsb11-s(p＝0.034)，并在接种后12小时，rsb11-r比rsb11-s受到更强烈的诱导(p＝1.79
×
10-6
)，达到rsb11-s的2.7倍水平(图1中f)。
[0119]
表2、用于rsb11基因测序的品种
[0120]
[0121][0122]
我们进一步构建了分别由rsb11-s型品种镇稻88和rsb11-r型品种湘晚籼7号(xwx7)的rsb11启动子驱动荧光素酶报告基因载体，在水稻原生质体中进行了瞬时表达试验，证实rsb11-r启动子比rsb11-s启动子更有效地促进报告基因的表达(图1中g)。其中，rsb11-r启动子的核苷酸序列如seq id no.4所示。
[0123]
以上结果表明，决定rsb11表达水平的启动子变异是导致rsb11-r和rsb11-s型水稻品种纹枯病抗性水平差异的原因。
[0124]
2、转基因植物的获得和表型鉴定
[0125]
为了验证rsb11是否参与调控水稻纹枯病抗性，我们首先在rsb11-s型水稻品种dongjin(dj)背景下鉴定到一个rsb11的t-dna插入突变体rsb11，rsb11是从一个t-dna插入突变体库中鉴定得到，编号为3d-50196l(jeon等人,2000；http://orygenesdb.cirad.fr/)，并利用分子标记p1、p2、p3(表1)确认t-dna插入在atg下游19bp位置，导致突变体中rsb11基因不表达(图2中a-c)。在田间接种试验中，我们发现与野生型wt(即dongjin(dj)，病级为6.09)相比，rsb11突变体(病级为7.38)更感纹枯病(图2中d和e)。接着将构建好的互补载体prsb11
xwx7
:crsb11
dj
(xwx7中的rsb11启动子驱动dj中的rsb11基因编码区)，通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法(hiei等人,the plant journal,6,217-282)，转入突变体rsb11中。将过量表达载体pubi:crsb11
dj
(玉米泛素ubi启动子驱动dongjin(dj)中的rsb11基因编码区)转化dongjin(dj)，分别获得了t0代15个互补系和20个t0代过表达系，我们最终确定了稳定的2个互补系(com-1和com-2)和3个过表达系(rsb11-oe1、rsb11-oe2和rsb11-oe3)用于接下来的试验。
[0126]
我们首先通过qrt-pcr检测了互补系和过表达系的rna表达水平。与wt植株相比，两个互补系都显示出明显增强的表达水平，在纹枯病菌rh-9接种后达到dongjin(dj)的约3倍水平，表明xwx7中的rsb11-r启动子确实比dongjin(dj)中的rsb11-s启动子能更强的启动rsb11的表达(图3中a)。三个过表达系也都清楚地显示出比wt高得多的转录水平(图3中b)。接着，我们在温室中鉴定了它们对纹枯病的抗性，两个互补系的病斑长度(15.49和15.71cm)明显短于wt(18.75cm)和rsb11突变体(23.84cm)(图3中c)。三个过表达系的病斑长度与互补系接近，且明显短于wt(图3中d)。此外，我们还通过crispr/cas9基因编辑系统
rsb11-r的病级为6.13，明显低于tg394(7.22)，表明rsb11-r在田间试验中具有很好的抗病效果(图6中b和c)。在重发病条件下，虽然tg394和nil-rsb11-r的植株产量和品质都明显下降，主要体现在结实率和千粒重下降，垩白粒率和直链淀粉含量增加(图6中d-i)，然而，nil-rsb11-r的产量损失明显低于tg394，tg394的产量从1404.0g/1.32m2降至1028.5g/1.32m2，下降26.75％，nil-rsb11-r的产量从1354.3g/1.32m2降至1126.6g/1.32m2，下降16.82％，因此，由于rsb11-r降低了纹枯病发病的严重程度，挽回9.54％的产量损失(图6中d)。进一步分析发现，被挽回的产量损失主要反映在两个产量成分上：结实率(6.75％)和千粒重(2.00％)(图6中e和f)。nil-rsb11-r在品质损失方面也明显低于tg394，包括较低的垩白粒率和直链淀粉含量，表明rsb11-r在重发病条件下也有利于品质的提升(图6中k和l)。综上结果表明优异自然等位变异rsb11-r在粳稻抗纹枯病育种中具有很大的应用潜力。
[0137]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。