一种同时检测药用野生稻和栽培稻的SSR分子标记扩增引物组合及其应用

一种同时检测药用野生稻和栽培稻的ssr分子标记扩增引物组合及其应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学及植物分子遗传育种领域，具体涉及可同时检测药用野生稻和栽培稻的ssr分子标记扩增引物组合及其应用。


背景技术：

2.世界上至今发现约27种野生稻，中国分布有3种，分别为普通野生稻(oryza rufipogon griff.)、药用野生稻(oryza officinalis wall.)和疣粒野生稻(oryza meyeriana nees.)。其中，普通野生稻的染色体组和栽培稻(oryza sativa l.)同为aa基因组，它们之间亲缘关系较为接近，而药用野生稻(cc基因组)和疣粒野生稻(gg基因组)与栽培稻的染色体组不一样，亲缘关系相对较远。普通野生稻在我国水稻育种历程中发挥了巨大作用，并取得了显著的效果。要实现水稻育种的新突破，选用非aa基因组的野生稻是新的途径。尤其药用野生稻，其具有独特的遗传性状，如植株高大、茎秆粗壮、高光效、高抗各种病虫害、耐冷、耐贫瘠等，这些性状对于培育新型水稻具有较好的发展前景。
3.一般将野生稻与栽培稻进行远缘杂交，通过不断回交和自交，达到培育新品种的目的，而在选育过程中，快速选育出目标材料尤为关键，常规选育耗时较长，通常需要选育3到6代以上方可获得纯合稳定株系，然而结合分子标记辅助选育可有效提高育种效率，至少可减少一半的工作量和工作时间。
4.分子标记辅助选育技术是通过与目的基因紧密连锁或共分离的分子标记，对dna目标区域进行直接筛选，因不受环境影响，提高了选择的可靠性和效率。在稻属植物中可以用于分子标记辅助选育的分子标记类型较多，如rflp(限制性内切酶片段长度多态性，restriction fragment length polymorphism，rflp)、rapd(随机扩增多态性dna标记，random amplified polymorphic dna)、issr(简单序列重复区间，inter-simple sequence repeat)、ssr(简单序列重复长度多态性，simple sequence repeat length polymorphism，)、indel(插入缺失长度多态性，insertion deletion length polymorphism，)和snp(单核苷酸多态性，single nucleotide polymorphism，)标记等等，其中的ssr分子标记具有以下优点：(1)数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高；(2)具有多等位基因的特性，提供的信息量高；(3)以孟德尔方式遗传，呈共显性；(4)每个位点由设计的引物顺序决定，便于不同的实验室相互交流合作开发引物；(5)通过常规pcr扩增反应，无需酶切，经过高浓度的琼脂糖凝胶电泳就可检测出多态性片段。
5.由美国cornell大学susan mccouch教授实验室建立的近3000个ssr分子标记，在农作物和模式植物基因组(gramene:a comparative resource for plants)数据库可查询，gramene数据库网址为http://www.gramene.org/，几乎平均分布在水稻12条染色体上，可以很好地用于确定一些性状的连锁分子标记，再进行辅助选育。然而，这些ssr标记是根据栽培稻日本晴设计的，因栽培稻与药用野生稻亲缘关系甚远，基因组序列差异较大，栽培稻中的一些ssr分子标记无法直接应用于药用野生稻中，虽然目前一些数据库已公布了药
用野生稻基因组数据，但这些数据基本都是零星的片段，具体的基因组详细信息仍然匮乏，若对药用野生稻基因组进行从头测序、高质量组装和解析，不仅耗费较高，工作量大，而且耗时也较长，所以有必要通过简单快速途径开发出能在药用野生稻中应用的ssr分子标记，尤其在药用野生稻与栽培稻进行远缘杂交选育过程中，开发出能同时检测药用野生稻和栽培稻的ssr分子标记至关重要。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题是克服目前药用野生稻基因组数据匮乏，若对药用野生稻基因组进行从头测序，耗费较高，工作量大，耗时较长，获取药用野生稻中ssr分子标记困难的缺陷，从而提供一种同时检测药用野生稻和栽培稻的ssr分子标记扩增引物组合及其应用。
7.为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
8.一种同时检测药用野生稻和栽培稻的ssr分子标记扩增引物组合，所述ssr分子标记扩增引物组合由如下72对ssr引物组成，所述72对ssr引物的编号为ssr1引物对至ssr72引物对，具体是：
9.ssr1引物对由seq id no：1所示的ssr1正向引物f和seq id no：2所示的ssr1反向引物r组成；
10.ssr2引物对由seq id no：3所示的ssr2正向引物f和seq id no：4所示的ssr2反向引物r组成；
11.ssr3引物对由seq id no：5所示的ssr3正向引物f和seq id no：6所示的ssr3反向引物r组成；
12.ssr4引物对由seq id no：7所示的ssr4正向引物f和seq id no：8所示的ssr4反向引物r组成；
13.ssr5引物对由seq id no：9所示的ssr5正向引物f和seq id no：10所示的ssr5反向引物r组成；
14.ssr6引物对由seq id no：11所示的ssr6正向引物f和seq id no：12所示的ssr6反向引物r组成；
15.ssr7引物对由seq id no：13所示的ssr7正向引物f和seq id no：14所示的ssr7反向引物r组成；
16.ssr8引物对由seq id no：15所示的ssr8正向引物f和seq id no：16所示的ssr8反向引物r组成；
17.ssr9引物对由seq id no：17所示的ssr9正向引物f和seq id no：18所示的ssr9反向引物r组成；
18.ssr10引物对由seq id no：19所示的ssr10正向引物f和seq id no：20所示的ssr10反向引物r组成；
19.ssr11引物对由seq id no：21所示的ssr11正向引物f和seq id no：22所示的ssr11反向引物r组成；
20.ssr12引物对由seq id no：23所示的ssr12正向引物f和seq id no：24所示的ssr12反向引物r组成；
21.ssr13引物对由seq id no：25所示的ssr13正向引物f和seq id no：26所示的ssr13反向引物r组成；
22.ssr14引物对由seq id no：27所示的ssr14正向引物f和seq id no：28所示的ssr14反向引物r组成；
23.ssr15引物对由seq id no：29所示的ssr15正向引物f和seq id no：30所示的ssr15反向引物r组成；
24.ssr16引物对由seq id no：31所示的ssr16正向引物f和seq id no：32所示的ssr16反向引物r组成；
25.ssr17引物对由seq id no：33所示的ssr17正向引物f和seq id no：34所示的ssr17反向引物r组成；
26.ssr18引物对由seq id no：35所示的ssr18正向引物f和seq id no：36所示的ssr18反向引物r组成；
27.ssr19引物对由seq id no：37所示的ssr19正向引物f和seq id no：38所示的ssr19反向引物r组成；
28.ssr20引物对由seq id no：39所示的ssr20正向引物f和seq id no：40所示的ssr20反向引物r组成；
29.ssr21引物对由seq id no：41所示的ssr21正向引物f和seq id no：42所示的ssr21反向引物r组成；
30.ssr22引物对由seq id no：43所示的ssr22正向引物f和seq id no：44所示的ssr22反向引物r组成；
31.ssr23引物对由seq id no：45所示的ssr23正向引物f和seq id no：46所示的ssr23反向引物r组成；
32.ssr24引物对由seq id no：47所示的ssr24正向引物f和seq id no：48所示的ssr24反向引物r组成；
33.ssr25引物对由seq id no：49所示的ssr25正向引物f和seq id no：50所示的ssr25反向引物r组成；
34.ssr26引物对由seq id no：51所示的ssr26正向引物f和seq id no：52所示的ssr26反向引物r组成；
35.ssr27引物对由seq id no：53所示的ssr27正向引物f和seq id no：54所示的ssr27反向引物r组成；
36.ssr28引物对由seq id no：55所示的ssr28正向引物f和seq id no：56所示的ssr28反向引物r组成；
37.ssr29引物对由seq id no：57所示的ssr29正向引物f和seq id no：58所示的ssr29反向引物r组成；
38.ssr30引物对由seq id no：59所示的ssr30正向引物f和seq id no：60所示的ssr30反向引物r组成；
39.ssr31引物对由seq id no：61所示的ssr31正向引物f和seq id no：62所示的ssr31反向引物r组成；
40.ssr32引物对由seq id no：63所示的ssr32正向引物f和seq id no：64所示的
ssr32反向引物r组成；
41.ssr33引物对由seq id no：65所示的ssr33正向引物f和seq id no：66所示的ssr33反向引物r组成；
42.ssr34引物对由seq id no：67所示的ssr34正向引物f和seq id no：68所示的ssr34反向引物r组成；
43.ssr35引物对由seq id no：69所示的ssr35正向引物f和seq id no：70所示的ssr35反向引物r组成；
44.ssr36引物对由seq id no：71所示的ssr36正向引物f和seq id no：72所示的ssr36反向引物r组成；
45.ssr37引物对由seq id no：73所示的ssr37正向引物f和seq id no：74所示的ssr37反向引物r组成；
46.ssr38引物对由seq id no：75所示的ssr38正向引物f和seq id no：76所示的ssr38反向引物r组成；
47.ssr39引物对由seq id no：77所示的ssr39正向引物f和seq id no：78所示的ssr39反向引物r组成；
48.ssr40引物对由seq id no：79所示的ssr40正向引物f和seq id no：80所示的ssr40反向引物r组成；
49.ssr41引物对由seq id no：81所示的ssr41正向引物f和seq id no：82所示的ssr41反向引物r组成；
50.ssr42引物对由seq id no：83所示的ssr42正向引物f和seq id no：84所示的ssr42反向引物r组成；
51.ssr43引物对由seq id no：85所示的ssr43正向引物f和seq id no：86所示的ssr43反向引物r组成；
52.ssr44引物对由seq id no：87所示的ssr44正向引物f和seq id no：88所示的ssr44反向引物r组成；
53.ssr45引物对由seq id no：89所示的ssr45正向引物f和seq id no：90所示的ssr45反向引物r组成；
54.ssr46引物对由seq id no：91所示的ssr46正向引物f和seq id no：92所示的ssr46反向引物r组成；
55.ssr47引物对由seq id no：93所示的ssr47正向引物f和seq id no：94所示的ssr47反向引物r组成；
56.ssr48引物对由seq id no：95所示的ssr48正向引物f和seq id no：96所示的ssr48反向引物r组成；
57.ssr49引物对由seq id no：97所示的ssr49正向引物f和seq id no：98所示的ssr49反向引物r组成；
58.ssr50引物对由seq id no：99所示的ssr50正向引物f和seq id no：100所示的ssr50反向引物r组成；
59.ssr51引物对由seq id no：101所示的ssr51正向引物f和seq id no：102所示的ssr51反向引物r组成；
60.ssr52引物对由seq id no：103所示的ssr52正向引物f和seq id no：104所示的ssr52反向引物r组成；
61.ssr53引物对由seq id no：105所示的ssr53正向引物f和seq id no：106所示的ssr53反向引物r组成；
62.ssr54引物对由seq id no：107所示的ssr54正向引物f和seq id no：108所示的ssr54反向引物r组成；
63.ssr55引物对由seq id no：109所示的ssr55正向引物f和seq id no：110所示的ssr55反向引物r组成；
64.ssr56引物对由seq id no：111所示的ssr56正向引物f和seq id no：112所示的ssr56反向引物r组成；
65.ssr57引物对由seq id no：113所示的ssr57正向引物f和seq id no：114所示的ssr57反向引物r组成；
66.ssr58引物对由seq id no：115所示的ssr58正向引物f和seq id no：116所示的ssr58反向引物r组成；
67.ssr59引物对由seq id no：117所示的ssr59正向引物f和seq id no：118所示的ssr59反向引物r组成；
68.ssr60引物对由seq id no：119所示的ssr60正向引物f和seq id no：120所示的ssr60反向引物r组成；
69.ssr61引物对由seq id no：121所示的ssr61正向引物f和seq id no：122所示的ssr61反向引物r组成；
70.ssr62引物对由seq id no：123所示的ssr62正向引物f和seq id no：124所示的ssr62反向引物r组成；
71.ssr63引物对由seq id no：125所示的ssr63正向引物f和seq id no：126所示的ssr63反向引物r组成；
72.ssr64引物对由seq id no：127所示的ssr64正向引物f和seq id no：128所示的ssr64反向引物r组成；
73.ssr65引物对由seq id no：129所示的ssr65正向引物f和seq id no：130所示的ssr65反向引物r组成；
74.ssr66引物对由seq id no：131所示的ssr66正向引物f和seq id no：132所示的ssr66反向引物r组成；
75.ssr67引物对由seq id no：133所示的ssr67正向引物f和seq id no：134所示的ssr67反向引物r组成；
76.ssr68引物对由seq id no：135所示的ssr68正向引物f和seq id no：136所示的ssr68反向引物r组成；
77.ssr69引物对由seq id no：137所示的ssr69正向引物f和seq id no：138所示的ssr69反向引物r组成；
78.ssr70引物对由seq id no：139所示的ssr70正向引物f和seq id no：140所示的ssr70反向引物r组成；
79.ssr71引物对由seq id no：141所示的ssr71正向引物f和seq id no：142所示的
ssr71反向引物r组成；
80.ssr72引物对由seq id no：143所示的ssr72正向引物f和seq id no：144所示的ssr72反向引物r组成。
81.本发明还提供一种同时检测药用野生稻和栽培稻的ssr分子标记扩增引物组合在以下任一方面中的应用：
82.(1)药用野生稻与栽培稻杂交群体分子标记检测分析；
83.(2)药用野生稻和栽培稻之间的多态性检测。
84.进一步，上述应用中(1)或(2)包括以下步骤：
85.(a)分别提取药用野生稻和栽培稻的基因组dna；
86.(b)分别以步骤(a)中药用野生稻和栽培稻的dna为模板，分别以上述一种同时检测药用野生稻和栽培稻的ssr分子标记扩增引物组合中任意1对以上ssr引物对进行pcr扩增，并将pcr扩增产物通过4％～4.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测。
87.进一步，上述应用步骤(b)中所述pcr扩增的反应体系为15μl，其中，20ng/μl～30ng/μl的dna 2μl，每对ssr引物的正向引物f和反向引物r分别为0.5μl，1
×
taq pcr master mix12μl。
88.进一步，上述应用步骤(b)中所述pcr扩增的反应条件为：94℃变性5min；循环内94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，共40个循环，最后72℃延伸10min。
89.本发明还提供一种开发同时检测药用野生稻和栽培稻的ssr分子标记集和/或同时检测药用野生稻和栽培稻的ssr分子标记扩增引物组合的方法，其特征在于，包括以下步骤：
90.(1)根据gramene数据库markers中平均分布在水稻12条染色体的ssr分子标记的位点，以水稻日本晴每条染色体大小进行计算，ssr分子标记之间间隔4～8mb，从gramene数据库中下载ssr分子标记序列，根据所述ssr分子标记位点重复基序的侧翼序列，设计ssr分子标记及其对应的ssr引物对，所述ssr分子标记及其对应的ssr引物对设计是指在ncbi数据库中的primer-blast程序中进行；
91.(2)收集1份药用野生稻和1份栽培稻日本晴进行ssr引物对的筛选；采用植物dna提取试剂盒，分别提取这2份材料的基因组dna，分别以这2份材料的dna为模板，每份样品加入步骤(1)中所得到的1对ssr引物的正向引物和反向引物，进行pcr扩增，每个pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出在药用野生稻样品和栽培稻样品均带型清晰，且相同或存在多样性差异的ssr分子标记及其对应的ssr引物对，所筛选出的各ssr分子标记构成所述的同时检测药用野生稻和栽培稻的ssr分子标记集，所筛选出的各ssr分子标记对应的各ssr引物对构成所述的同时检测药用野生稻和栽培稻的ssr分子标记扩增引物组合。
92.进一步，所述的方法步骤(2)中每个pcr扩增的反应体系为15μl，其中，20ng/μl～30ng/μl的dna2μl，每对ssr引物的正向引物和反向引物分别为0.5μl，以及1
×
taq pcrmaster mix 12μl。
93.进一步，所述的方法步骤(2)中每个pcr扩增的反应条件为：94℃变性5min；循环内94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，共40个循环，最后72℃延伸10min。
94.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
95.(1)药用野生稻(cc基因组)和栽培稻(aa基因组)虽亲缘关系较远，但二者同属于
稻属植物，在基因组上的一些区域具有同源性，根据该特性，依据目前基因组解析较为清楚的栽培稻日本晴，开发ssr分子标记，通过pcr筛选出能在两种稻属植物中同时运用的ssr分子标记及其扩增引物，操作简单，效率高。正常的ssr分子标记的开发，需根据供试品种的基因组详细信息，如基因序列在染色体上的顺序和方向，根据这些信息查找出相应区域的简单重复序列(ssr标记)，再根据这些序列设计引物，通过pcr进行验证。然而目前药用野生稻的基因组数据基本为小片段，无法清楚地明确基因序列在染色体上的顺序和方向，然而通过本发明中药用野生稻ssr分子标记开发方法，能有效克服药用野生稻中ssr分子标记获取困难的问题。
96.(2)本发明提供的72对ssr引物，可为检测药用野生稻的分子多样性，以及药用野生稻中优良基因导入栽培稻后的选育提供标记资源。
97.序列表中：
98.seq id no：1所示的是ssr1正向引物f的核苷酸序列。
99.seq id no：2所示的是ssr1反向引物r的核苷酸序列。
100.seq id no：3所示的是ssr2正向引物f的核苷酸序列。
101.seq id no：4所示的是ssr2反向引物r的核苷酸序列。
102.seq id no：5所示的是ssr3正向引物f的核苷酸序列。
103.seq id no：6所示的是ssr3反向引物r的核苷酸序列。
104.seq id no：7所示的是ssr4正向引物f的核苷酸序列。
105.seq id no：8所示的是ssr4反向引物r的核苷酸序列。
106.seq id no：9所示的是ssr5正向引物f的核苷酸序列。
107.seq id no：10所示的是ssr5反向引物r的核苷酸序列。
108.seq id no：11所示的是ssr6正向引物f的核苷酸序列。
109.seq id no：12所示的是ssr6反向引物r的核苷酸序列。
110.seq id no：13所示的是ssr7正向引物f的核苷酸序列。
111.seq id no：14所示的是ssr7反向引物r的核苷酸序列。
112.seq id no：15所示的是ssr8正向引物f的核苷酸序列。
113.seq id no：16所示的是ssr8反向引物r的核苷酸序列。
114.seq id no：17所示的是ssr9正向引物f的核苷酸序列。
115.seq id no：18所示的是ssr9反向引物r的核苷酸序列。
116.seq id no：19所示的是ssr10正向引物f的核苷酸序列。
117.seq id no：20所示的是ssr10反向引物r的核苷酸序列。
118.seq id no：21所示的是ssr11正向引物f的核苷酸序列。
119.seq id no：22所示的是ssr11反向引物r的核苷酸序列。
120.seq id no：23所示的是ssr12正向引物f的核苷酸序列。
121.seq id no：24所示的是ssr12反向引物r的核苷酸序列。
122.seq id no：25所示的是ssr13正向引物f的核苷酸序列。
123.seq id no：26所示的是ssr13反向引物r的核苷酸序列。
124.seq id no：27所示的是ssr14正向引物f的核苷酸序列。
125.seq id no：28所示的是ssr14反向引物r的核苷酸序列。
126.seq id no：29所示的是ssr15正向引物f的核苷酸序列。
127.seq id no：30所示的是ssr15反向引物r的核苷酸序列。
128.seq id no：31所示的是ssr16正向引物f的核苷酸序列。
129.seq id no：32所示的是ssr16反向引物r的核苷酸序列。
130.seq id no：33所示的是ssr17正向引物f的核苷酸序列。
131.seq id no：34所示的是ssr17反向引物r的核苷酸序列。
132.seq id no：35所示的是ssr18正向引物f的核苷酸序列。
133.seq id no：36所示的是ssr18反向引物r的核苷酸序列。
134.seq id no：37所示的是ssr19正向引物f的核苷酸序列。
135.seq id no：38所示的是ssr19反向引物r的核苷酸序列。
136.seq id no：39所示的是ssr20正向引物f的核苷酸序列。
137.seq id no：40所示的是ssr20反向引物r的核苷酸序列。
138.seq id no：41所示的是ssr21正向引物f的核苷酸序列。
139.seq id no：42所示的是ssr21反向引物r的核苷酸序列。
140.seq id no：43所示的是ssr22正向引物f的核苷酸序列。
141.seq id no：44所示的是ssr22反向引物r的核苷酸序列。
142.seq id no：45所示的是ssr23正向引物f的核苷酸序列。
143.seq id no：46所示的是ssr23反向引物r的核苷酸序列。
144.seq id no：47所示的是ssr24正向引物f的核苷酸序列。
145.seq id no：48所示的是ssr24反向引物r的核苷酸序列。
146.seq id no：49所示的是ssr25正向引物f的核苷酸序列。
147.seq id no：50所示的是ssr25反向引物r的核苷酸序列。
148.seq id no：51所示的是ssr26正向引物f的核苷酸序列。
149.seq id no：52所示的是ssr26反向引物r的核苷酸序列。
150.seq id no：53所示的是ssr27正向引物f的核苷酸序列。
151.seq id no：54所示的是ssr27反向引物r的核苷酸序列。
152.seq id no：55所示的是ssr28正向引物f的核苷酸序列。
153.seq id no：56所示的是ssr28反向引物r的核苷酸序列。
154.seq id no：57所示的是ssr29正向引物f的核苷酸序列。
155.seq id no：58所示的是ssr29反向引物r的核苷酸序列。
156.seq id no：59所示的是ssr30正向引物f的核苷酸序列。
157.seq id no：60所示的是ssr30反向引物r的核苷酸序列。
158.seq id no：61所示的是ssr31正向引物f的核苷酸序列。
159.seq id no：62所示的是ssr31反向引物r的核苷酸序列。
160.seq id no：63所示的是ssr32正向引物f的核苷酸序列。
161.seq id no：64所示的是ssr32反向引物r的核苷酸序列。
162.seq id no：65所示的是ssr33正向引物f的核苷酸序列。
163.seq id no：66所示的是ssr33反向引物r的核苷酸序列。
164.seq id no：67所示的是ssr34正向引物f的核苷酸序列。
165.seq id no：68所示的是ssr34反向引物r的核苷酸序列。
166.seq id no：69所示的是ssr35正向引物f的核苷酸序列。
167.seq id no：70所示的是ssr35反向引物r的核苷酸序列。
168.seq id no：71所示的是ssr36正向引物f的核苷酸序列。
169.seq id no：72所示的是ssr36反向引物r的核苷酸序列。
170.seq id no：73所示的是ssr37正向引物f的核苷酸序列。
171.seq id no：74所示的是ssr37反向引物r的核苷酸序列。
172.seq id no：75所示的是ssr38正向引物f的核苷酸序列。
173.seq id no：76所示的是ssr38反向引物r的核苷酸序列。
174.seq id no：77所示的是ssr39正向引物f的核苷酸序列。
175.seq id no：78所示的是ssr39反向引物r的核苷酸序列。
176.seq id no：79所示的是ssr40正向引物f的核苷酸序列。
177.seq id no：80所示的是ssr40反向引物r的核苷酸序列。
178.seq id no：81所示的是ssr41正向引物f的核苷酸序列。
179.seq id no：82所示的是ssr41反向引物r的核苷酸序列。
180.seq id no：83所示的是ssr42正向引物f的核苷酸序列。
181.seq id no：84所示的是ssr42反向引物r的核苷酸序列。
182.seq id no：85所示的是ssr43正向引物f的核苷酸序列。
183.seq id no：86所示的是ssr43反向引物r的核苷酸序列。
184.seq id no：87所示的是ssr44正向引物f的核苷酸序列。
185.seq id no：88所示的是ssr44反向引物r的核苷酸序列。
186.seq id no：89所示的是ssr45正向引物f的核苷酸序列。
187.seq id no：90所示的是ssr45反向引物r的核苷酸序列。
188.seq id no：91所示的是ssr46正向引物f的核苷酸序列。
189.seq id no：92所示的是ssr46反向引物r的核苷酸序列。
190.seq id no：93所示的是ssr47正向引物f的核苷酸序列。
191.seq id no：94所示的是ssr47反向引物r的核苷酸序列。
192.seq id no：95所示的是ssr48正向引物f的核苷酸序列。
193.seq id no：96所示的是ssr48反向引物r的核苷酸序列。
194.seq id no：97所示的是ssr49正向引物f的核苷酸序列。
195.seq id no：98所示的是ssr49反向引物r的核苷酸序列。
196.seq id no：99所示的是ssr50正向引物f的核苷酸序列。
197.seq id no：100所示的是ssr50反向引物r的核苷酸序列。
198.seq id no：101所示的是ssr51正向引物f的核苷酸序列。
199.seq id no：102所示的是ssr51反向引物r的核苷酸序列。
200.seq id no：103所示的是ssr52正向引物f的核苷酸序列。
201.seq id no：104所示的是ssr52反向引物r的核苷酸序列。
202.seq id no：105所示的是ssr53正向引物f的核苷酸序列。
203.seq id no：106所示的是ssr53反向引物r的核苷酸序列。
204.seq id no：107所示的是ssr54正向引物f的核苷酸序列。
205.seq id no：108所示的是ssr54反向引物r的核苷酸序列。
206.seq id no：109所示的是ssr55正向引物f的核苷酸序列。
207.seq id no：110所示的是ssr55反向引物r的核苷酸序列。
208.seq id no：111所示的是ssr56正向引物f的核苷酸序列。
209.seq id no：112所示的是ssr56反向引物r的核苷酸序列。
210.seq id no：113所示的是ssr57正向引物f的核苷酸序列。
211.seq id no：114所示的是ssr57反向引物r的核苷酸序列。
212.seq id no：115所示的是ssr58正向引物f的核苷酸序列。
213.seq id no：116所示的是ssr58反向引物r的核苷酸序列。
214.seq id no：117所示的是ssr59正向引物f的核苷酸序列。
215.seq id no：118所示的是ssr59反向引物r的核苷酸序列。
216.seq id no：119所示的是ssr60正向引物f的核苷酸序列。
217.seq id no：120所示的是ssr60反向引物r的核苷酸序列。
218.seq id no：121所示的是ssr61正向引物f的核苷酸序列。
219.seq id no：122所示的是ssr61反向引物r的核苷酸序列。
220.seq id no：123所示的是ssr62正向引物f的核苷酸序列。
221.seq id no：124所示的是ssr62反向引物r的核苷酸序列。
222.seq id no：125所示的是ssr63正向引物f的核苷酸序列。
223.seq id no：126所示的是ssr63反向引物r的核苷酸序列。
224.seq id no：127所示的是ssr64正向引物f的核苷酸序列。
225.seq id no：128所示的是ssr64反向引物r的核苷酸序列。
226.seq id no：129所示的是ssr65正向引物f的核苷酸序列。
227.seq id no：130所示的是ssr65反向引物r的核苷酸序列。
228.seq id no：131所示的是ssr66正向引物f的核苷酸序列。
229.seq id no：132所示的是ssr66反向引物r的核苷酸序列。
230.seq id no：133所示的是ssr67正向引物f的核苷酸序列。
231.seq id no：134所示的是ssr67反向引物r的核苷酸序列。
232.seq id no：135所示的是ssr68正向引物f的核苷酸序列。
233.seq id no：136所示的是ssr68反向引物r的核苷酸序列。
234.seq id no：137所示的是ssr69正向引物f的核苷酸序列。
235.seq id no：138所示的是ssr69反向引物r的核苷酸序列。
236.seq id no：139所示的是ssr70正向引物f的核苷酸序列。
237.seq id no：140所示的是ssr70反向引物r的核苷酸序列。
238.seq id no：141所示的是ssr71正向引物f的核苷酸序列。
239.seq id no：142所示的是ssr71反向引物r的核苷酸序列。
240.seq id no：143所示的是ssr72正向引物f的核苷酸序列。
241.seq id no：144所示的是ssr72反向引物r的核苷酸序列。
附图说明
242.图1：42个ssr分子标记对应的ssr引物对在孟定药用野生稻33号和栽培稻hy-8中的多态性扩增示意图。图1中：1代表药用野生稻孟定33号；2代表栽培稻hy-8；s1代表ssr3分子标记、s2代表ssr4分子标记、s3代表ssr6分子标记、s4代表ssr8分子标记、s5代表ssr9分子标记、s6代表ssr10分子标记、s7代表ssr11分子标记、s8代表ssr12分子标记、s9代表ssr13分子标记、s10代表ssr14分子标记、s11代表ssr15分子标记、s12代表ssr24分子标记、s13代表ssr27分子标记、s14代表ssr28分子标记、s15代表ssr32分子标记、s16代表ssr33分子标记、s17代表ssr34分子标记、s18代表ssr35分子标记、s19代表ssr37分子标记、s20代表ssr38分子标记、s21代表ssr40分子标记、s22代表ssr41分子标记、s23代表ssr42分子标记、s24代表ssr43分子标记、s25代表ssr44分子标记、s26代表ssr47分子标记、s27代表ssr48分子标记、s28代表ssr50分子标记、s29代表ssr52分子标记、s30代表ssr53分子标记、s31代表ssr54分子标记、s32代表ssr55分子标记、s33代表ssr56分子标记、s34代表ssr57分子标记、s35代表ssr58分子标记、s36代表ssr59分子标记、s37代表ssr60分子标记、s38代表ssr64分子标记、s39代表ssr66分子标记、s40代表ssr69分子标记、s41代表ssr70分子标记、s42代表ssr71分子标记。
243.图2：为来自在1号染色体的ssr6分子标记在12份药用野生稻和12份栽培稻中的多态性扩增示意图。marker代表标准分子量标记(dl1000 marker)，从上到下分别为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp。
244.图3：为来自2号染色体的ssr8分子标记在12份药用野生稻和12份栽培稻中的多态性扩增示意图。marker代表标准分子量标记(dl1000 marker)，从上到下分别为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp。
245.图4：为来自3号染色体的ssr15分子标记在12份药用野生稻和12份栽培稻中的多态性扩增示意图。marker代表标准分子量标记(dl1000 marker)，从上到下分别为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp。
246.图5：为来自4号染色体的ssr24分子标记在12份药用野生稻和12份栽培稻中的多态性扩增示意图。marker代表标准分子量标记(dl1000 marker)，从上到下分别为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp。
247.图6：为来自5号染色体的ssr27分子标记在12份药用野生稻和12份栽培稻中的多态性扩增示意图。marker代表标准分子量标记(dl1000 marker)，从上到下分别为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp。
248.图7：为来自6号染色体的ssr32分子标记在12份药用野生稻和12份栽培稻中的多态性扩增示意图。marker代表标准分子量标记(dl1000 marker)，从上到下分别为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp。
249.图8：为来自7号染色体的ssr40分子标记在12份药用野生稻和12份栽培稻中的多态性扩增示意图。marker代表标准分子量标记(dl1000 marker)，从上到下分别为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp。
250.图9：为来自8号染色体的ssr43分子标记在12份药用野生稻和12份栽培稻中的多态性扩增示意图。marker代表标准分子量标记(dl1000 marker)，从上到下分别为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp。
251.图10：为来自9号染色体的ssr53分子标记在12份药用野生稻和12份栽培稻中的多态性扩增示意图。marker代表标准分子量标记(dl1000 marker)，从上到下分别为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp。
252.图11：为来自10号染色体的ssr55分子标记在12份药用野生稻和12份栽培稻中的多态性扩增示意图。marker代表标准分子量标记(dl1000 marker)，从上到下分别为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp。
253.图12：为来自11号染色体的ssr64分子标记在12份药用野生稻和12份栽培稻中的多态性扩增示意图。marker代表标准分子量标记(dl1000 marker)，从上到下分别为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp。
254.图13：为来自12号染色体的ssr69分子标记在12份药用野生稻和12份栽培稻中的多态性扩增示意图。marker代表标准分子量标记(dl1000 marker)，从上到下分别为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp。
255.图14：12份药用野生稻和12份栽培稻分子聚类图。
具体实施方式
256.下面通过具体实施例对本技术作进一步的说明。在此需要说明的是，所述的实施例是本技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，而不构成对本发明的限定。
257.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述的试验材料，如无特殊说明，均是通过常规的商业途径购买或按我国相关规定获得。
258.一、来自云南不同地区的药用野生稻13份：孟定33号、景洪11号、景洪15号、景讷31号、景洪26号、罕宏4号、曼老4号、曼窝2号、孟定28号、勐海7号、勐往71号、勐遮12号、南邻2号。前述13份药用野生稻是13个药用野生稻植株，其名称及编号为本研究实验室自编。
259.二、不同的栽培稻：
260.hy-8，为我国选育的籼型常规水稻，公布于文献“li ex et al.screening of highly efficient photosynthetic hybrids of oryza officinalis and analysis of their photosynthetic pathway genes.photosynthetica，2021，59(2)：303～312”。
261.细烂地谷，来自云南省作物种质资源库，为云南地方籼稻品种，公布于文献“zhao cm et al.identification of bacterial blight resistance genes in rice landraces from yunnan province,china.australasian plant pathology，2022，51：59～69”。
262.扎昌龙(市售)，为云南地方粳稻品种，公布于文献“高和平等.云南稻种对几个白叶枯菌系的抗性遗传研究.孝感师专学报(自然科学版)，1999，19(4)：68～71”。
263.绿香米(市售)，为农家生态米，公布于文献“谢玲娟等.不同彩色稻品种(系)农艺性状和品质性状的比较分析.河南农业科学，2019，48(6)：36～45”。
264.合系35(市售)，为我国选育的常规粳型水稻，公布于文献“殷富有等.普通野生稻栽培稻杂交后代白叶枯病抗性评价.江西农业学报，2010，22(8)：81～84”。
265.金刚30(市售)，为我国选育的籼型常规水稻，公布于文献“冯爱卿等.广东水稻细菌性条斑病菌致病性分化研究.广东农业科学，2018，45(9)：84～89”。
266.明恢63(市售)，为我国选育的籼型常规水稻，公布于文献“吴方喜等.籼型杂交稻恢复系明恢63的利用与创新.福建农业学报，2011，26(6)：1101～1112”。
267.日本晴(市售)，为日本选育的粳型常规水稻，公布于文献“胡雅丽等.水稻典型品种日本晴和ir24根系微生物组的解析.遗传，2020，42(5)：506～518”。
268.浙辐7号(市售)，为我国选育的籼型常规水稻，公布于专著“万建民.中国水稻遗传育种与品种系谱(1986-2005).北京：中国农业出版社，2010：251.”。
269.ir24(市售)，为国际水稻所选育的籼型常规水稻，公布于文献“胡雅丽等.水稻典型品种日本晴和ir24根系微生物组的解析.遗传，2020，42(5)：506～518”。
270.02428(市售)，为我国选育的粳型常规水稻，公布于文献“姜洁锋等.回交改良广亲和水稻02428的垩白性状.浙江农业科学，2019，60(10)：1747～1749”。
271.9311(市售)，为我国选育的籼型常规水稻，公布于文献“路佳岚等.不同光温条件对水稻9311产量及品质的影响.江苏农业科学，2020，36(3)：535～543”。
272.上述hy-8、细烂地谷申请人有保存，可提供，联系地址：云南省昆明市盘龙区北京路2238号，云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，邮政编码：650205。
273.缩略词：
274.gramene数据库：农作物和模式植物基因组(gramene:a comparative resource for plants)gramene数据库可查询，gramene数据库网址为https：//archive.gramene.org/
275.ncbi：美国国家生物技术信息中心，national center for biotechnology information，简称ncbi。ncbi数据库：美国国家生物技术信息中心数据库，网站：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/实施例1可同时检测药用野生稻和栽培稻的ssr分子标记扩增ssr引物对开发
276.实施例1主要是从gramene数据库中下载平均分布在水稻12条染色体的72个ssr分子标记，72个ssr分子标记分布在72个位点(参照日本晴基因组)上，根据下载的72个ssr分子标记引物对，首先利用孟定药用野生稻与栽培稻日本晴进行筛选；其次根据下载的72个ssr分子标记的重复基序两端序列设计新的ssr分子标记及其对应的ssr引物对序列。
277.一、gramene数据库中ssr分子标记及其ssr引物对下载
278.从gramene数据库markers中下载ssr分子标记，依据每条染色体大小进行计算(染色体大小/6)，ssr分子标记之间间隔4～8mb，每条染色体下载6个ssr分子标记及对应的引物对，每个位点下载1个分子标记及其对应的引物对，共下载72个分子标记及其引物对。
279.二、ssr分子标记及其引物筛选
280.收集1份药用野生稻孟定33号和1份栽培稻日本晴进行引物筛选。采用植物dna提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)，分别提取该2份材料的基因组dna，分别以该2份材料的dna为模板，等分成至少与所述的引物对数量相等的样品，每个样品分别加入上述分子标记相对应的1个引物对的正向引物f和反向引物r，以及1
×
taq pcr mastermix(购自北京擎科生物科技有限公司)进行pcr扩增。每个pcr扩增的反应体系为15μl，其中，20ng/μl～30ng/μl的dna 2μl，每对ssr引物的正向引物f和反向引物r分别为0.5μl，以及1
×
taq pcr master mix 12μl。每个pcr扩增的反应条件为：94℃变性5min；循环内94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，共40个循环，最后72℃延伸10min。
281.将上述每个pcr扩增产物进行4％～4.5％琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出在药用野生稻样品和栽培稻样品带型清晰，且带型相同或存在多态性差异的ssr分子标记及其对应的ssr引物对，所述存在多态性差异是指在药用野生稻和栽培稻日本晴中都扩增出的ssr分子标记条带，而该条带片段大小在药用野生稻和栽培稻日本晴中存在5bp以上差异；最终获得38个能同时检测孟定33号和日本晴的ssr分子标记及其引物对。38个ssr分子标记及其引物对序列信息如表1所示。从表1可见，38个ssr分子标记并未均匀分布在12条染色体上，只在38个位点，需再开发34个新的ssr分子标记及其引物对。
282.表1来自gramene数据库的38个能同时检测孟定药用野生稻与栽培稻日本晴的高质量ssr分子标记及其引物对的序列信息
[0283][0284][0285]
三、新ssr分子标记及其新引物对开发
[0286]
72个ssr标记在药用野生稻孟定33号与栽培稻日本晴中只筛选到38个高质量ssr分子标记，这38个ssr分子标记并未均匀分布在12条染色体上(见表1)，为此，还需根据gramene数据库markers中平均分布在水稻12条染色体的ssr分子标记的位点(此处是与实
施例1“一”中所述ssr分子标记不同的其余ssr分子标记位点)，以水稻日本晴每条染色体大小进行计算，ssr分子标记之间间隔4～8mb，根据其ssr分子标记所在位点重复基序的侧翼序列，重新设计新的ssr分子标记及其对应的ssr引物对，所述新的ssr分子标记及其对应的ssr引物对设计是指在ncbi数据库中的primer-blast程序中进行。
[0287]
将新设计好的ssr分子标记引物对按照实施例1中“二、ssr分子标记及其引物筛选”所述的方法在孟定33号和栽培稻日本晴中再进行pcr筛选，最终获得新的34个在孟定33号和栽培稻日本晴中扩增带型特异且清晰的ssr分子标记。新的34个ssr分子标记及其ssr引物对序列信息如表2所示。
[0288]
表2新开发的34个能同时检测孟定药用野生稻与栽培稻日本晴的高质量ssr分子标记及其ssr引物对的序列信息
[0289]
[0290][0291]
注：表1和表2中染色体号是在所有水稻包括药用野生稻及其他野生稻上的染色体号。
[0292]
表1和表2中ssr分子标记均匀分布在水稻12条染色体上，每条染色体有6个ssr分子标记，表1和表2中合计的72个ssr分子标记的其它生物信息如下：
[0293]
ssr1分子标记在gramene数据库的名称为rm1282，重复基序为(ag)17。
[0294]
ssr2分子标记在gramene数据库的名称为rm292，重复基序为(gt)10-6-(tga)2tgt(tga)4。
[0295]
ssr3分子标记是通过gramene数据库中rm513的(tc)11重复基序两端重新设计。
[0296]
ssr4分子标记在gramene数据库的名称为rm11307，重复基序为(ga)15。
[0297]
ssr5分子标记是通过gramene数据库中rm3738的(ga)16重复基序两端重新设计。
[0298]
ssr6分子标记是通过gramene数据库中rm6840的(tct)17重复基序两端重新设计。
[0299]
ssr7分子标记是通过gramene数据库中rm7252的(atct)6重复基序两端重新设计。
[0300]
ssr8分子标记在gramene数据库的名称为rm174，重复基序为(agg)7(ga)10。
[0301]
ssr9分子标记是通过gramene数据库中rm5521的(tg)12重复基序两端重新设计。
[0302]
ssr10分子标记在gramene数据库的名称为rm13542，重复基序为(gcg)9。
[0303]
ssr11分子标记是通过gramene数据库中rm3763的(ga)18重复基序两端重新设计。
[0304]
ssr12分子标记是通过gramene数据库中rm7485的(tatc)7重复基序两端重新设计。
[0305]
ssr13分子标记是通过gramene数据库中rm3894的(gt)15重复基序两端重新设计。
[0306]
ssr14分子标记在gramene数据库的名称为rm5477，重复基序为(tc)21。
[0307]
ssr15分子标记是通过gramene数据库中rm7425的(ggca)6重复基序两端重新设计。
[0308]
ssr16分子标记是通过gramene数据库中rm7642的(ttta)7重复基序两端重新设计。
[0309]
ssr17分子标记是通过gramene数据库中rm3646的(ga)14重复基序两端重新设计。
[0310]
ssr18分子标记是通过gramene数据库中rm3525的(ct)33重复基序两端重新设计。
[0311]
ssr19分子标记在gramene数据库的名称为rm7585，重复基序为(tctt)6。
[0312]
ssr20分子标记在gramene数据库的名称为rm261，重复基序为c9(ct)8。
[0313]
ssr21分子标记在gramene数据库的名称为rm401，重复基序为(ct)15。
[0314]
ssr22分子标记是通过gramene数据库中rm5979的(cat)15重复基序两端重新设计。
[0315]
ssr23分子标记在gramene数据库的名称为rm1370，重复基序为(ag)28。
[0316]
ssr24分子标记是通过gramene数据库中rm5608的(aag)9重复基序两端重新设计。
[0317]
ssr25分子标记在gramene数据库的名称为rm507，重复基序为(aaga)7。
[0318]
ssr26分子标记在gramene数据库的名称为rm169，重复基序为(ga)12。
[0319]
ssr27分子标记是通过gramene数据库中rm8014的(at)32重复基序两端重新设计。
[0320]
ssr28分子标记是通过gramene数据库中rm3695的(ga)15重复基序两端重新设计。
[0321]
ssr29分子标记是通过gramene数据库中rm6545的(gct)9重复基序两端重新设计。
[0322]
ssr30分子标记是通过gramene数据库中rm5818的(agt)12重复基序两端重新设计。
[0323]
ssr31分子标记在gramene数据库的名称为rm435，重复基序为(atg)7。
[0324]
ssr32分子标记是通过gramene数据库中rm253的(ga)25重复基序两端重新设计。
[0325]
ssr33分子标记是通过gramene数据库中rm5850的(ata)27重复基序两端重新设计。
[0326]
ssr34分子标记是通过gramene数据库中rm2229的(at)23重复基序两端重新设计。
[0327]
ssr35分子标记是通过gramene数据库中rm3567的(ga)12重复基序两端重新设计。
[0328]
ssr36分子标记是通过gramene数据库中rm5753的(act)15重复基序两端重新设计。
[0329]
ssr37分子标记在gramene数据库的名称为rm295，重复基序为(ga)2a(ga)3g2(ga)9。
[0330]
ssr38分子标记在gramene数据库的名称为rm21242，重复基序为(gtc)7。
[0331]
ssr39分子标记在gramene数据库的名称为rm542，重复基序为(ct)22。
[0332]
ssr40分子标记在gramene数据库的名称为rm11，重复基序为(ga)17。
[0333]
ssr41分子标记在gramene数据库的名称为rm455，重复基序为(ttct)5。
[0334]
ssr42分子标记在gramene数据库的名称为rm248，重复基序为(ct)25。
[0335]
ssr43分子标记在gramene数据库的名称为rm408，重复基序为(ct)13。
[0336]
ssr44分子标记在gramene数据库的名称为rm22529，重复基序为(ga)15。
[0337]
ssr45分子标记在gramene数据库的名称为rm331，重复基序为[(ctt)4gtt]2(ctt)11。
[0338]
ssr46分子标记是通过gramene数据库中rm6193的(cgg)8重复基序两端重新设计。
[0339]
ssr47分子标记是通过gramene数据库中rm210的(ct)23重复基序两端重新设计。
[0340]
ssr48分子标记在gramene数据库的名称为rm23643，重复基序为(ga)13。
[0341]
ssr49分子标记在gramene数据库的名称为rm23662，重复基序为(ggc)10。
[0342]
ssr50分子标记在gramene数据库的名称为rm23793，重复基序为(att)19。
[0343]
ssr51分子标记是通过gramene数据库中rm3912的(gt)22重复基序两端重新设计。
[0344]
ssr52分子标记在gramene数据库的名称为rm24271，重复基序为(tc)11。
[0345]
ssr53分子标记在gramene数据库的名称为rm160，重复基序为(gaa)23。
[0346]
ssr54分子标记在gramene数据库的名称为rm205，重复基序为(ct)25。
[0347]
ssr55分子标记在gramene数据库的名称为rm24855，重复基序为(cag)7。
[0348]
ssr56分子标记在gramene数据库的名称为rm216，重复基序为(ct)18。
[0349]
ssr57分子标记是通过gramene数据库中rm1126的(ag)12重复基序两端重新设计。
[0350]
ssr58分子标记是通过gramene数据库中rm5689的(aat)17重复基序两端重新设计。
[0351]
ssr59分子标记在gramene数据库的名称为rm184，重复基序为(ca)7。
[0352]
ssr60分子标记在gramene数据库的名称为rm25932，重复基序为(agg)7。
[0353]
ssr61分子标记是通过gramene数据库中rm6327的(ctt)18重复基序两端重新设计。
[0354]
ssr62分子标记在gramene数据库的名称为rm116，重复基序为(ct)9。
[0355]
ssr63分子标记是通过gramene数据库中rm5590的(tg)34重复基序两端重新设计。
[0356]
ssr64分子标记在gramene数据库的名称为rm21，重复基序为(ga)18。
[0357]
ssr65分子标记在gramene数据库的名称为rm206，重复基序为(ct)21。
[0358]
ssr66分子标记在gramene数据库的名称为rm2136，重复基序为(at)22。
[0359]
ssr67分子标记是通过gramene数据库中rm2851的(at)37重复基序两端重新设计。
[0360]
ssr68分子标记是通过gramene数据库中rm512的(ttta)5重复基序两端重新设计。
[0361]
ssr69分子标记是通过gramene数据库中rm5939的(att)47重复基序两端重新设计。
[0362]
ssr70分子标记在gramene数据库的名称为rm28050，重复基序为(ta)12。
[0363]
ssr71分子标记在gramene数据库的名称为rm28374，重复基序为(acta)5。
[0364]
ssr72分子标记是通过gramene数据库中rm1227的(ag)15重复基序两端重新设计。
[0365]
实施例1表明，采用本发明开发的72对全部ssr引物或其中任何一对ssr引物或多个ssr引物，有助于检测药用野生稻或药用野生稻与栽培稻之间的分子多态样性，以及药用野生稻中优良基因定位或导入栽培稻后的选育。
[0366]
实施例2药用野生稻与栽培稻杂交群体分子标记检测分析
[0367]
实施例2选用1份药用野生稻孟定33号、1份栽培稻hy-8及其不同杂交后代，包括1份f1代和21份bc3f1代材料。ssr引物对采用实施例1中开发出的72对ssr引物(表1和表2)。重点从中选出在孟定药用野生稻和栽培稻hy-8之间存在多态性的ssr分子标记，并对其杂交群体进行分型，从而进一步明确在bc3f1群体材料携带药用野生稻基因片段的情况。
[0368]
dna提取、pcr扩增和pcr产物检测方法同实施例1。
[0369]
1.孟定药用野生稻和栽培稻hy-8之间的多态性ssr分子标记筛选
[0370]
采用施例1中开发出的72对ssr引物(表1和表2)，在药用野生稻孟定33号和栽培稻hy-8之间进行pcr扩增，根据扩增情况筛选出在二者之间存在多态性的ssr分子标记，共获得42个多态性分子标记(图1)，其中1号染色体有3个多态性分子标记，分别为ssr3、ssr4和ssr6分子标记；2号有5个多态性分子标记，分别为ssr8、ssr9、ssr10、ssr11、ssr12；3号染色体有3个多态性分子标记，分别为ssr13、ssr14和ssr15分子标记；4号染色体有1个多态性分子标记，为ssr24；5号染色体有2个分子标记，分别为ssr27和ssr28；6号染色体有4个多态性分子标记，分别为ssr32、ssr33、ssr34和ssr35；7号染色体有5个分子标记，分别为ssr37、
ssr38、ssr40、ssr41和ssr42；8号染色体有4个分子标记，分别为ssr43、ssr44、ssr47和ssr48；9号染色体有4个分子标记，分别为ssr50、ssr52、ssr53和ssr54；10号染色体的6个分子标记都为多态性分子标记，分别为ssr55、ssr56、ssr57、ssr58、ssr59、ssr60；11号染色体有2个分子标记，分别为ssr64和ssr66；12号染色体有3个分子标记，分别为ssr69、ssr70和ssr71。
[0371]
2.bc3f1群体材料携带药用野生稻基因片段的情况
[0372]
利用上述筛选到的42个多态性分子标记对应的ssr引物对在bc3f1群体材料中进行扩增，以孟定33号和hy-8两个亲本pcr产物带型为对照，将与孟定33号带型一致的记为“a”，与hy-8一致的记为“b”，同时存在两个亲本的带型(杂合带型)记为“h”，其余带型记为“c”。统计结果见表3，从表3可见，ssr3、ssr12、ssr14、ssr24、ssr34、ssr35、ssr37、ssr38、ssr40、ssr41、ssr42、ssr44、ssr47、ssr48、ssr50、ssr53、ssr56、ssr58、ssr59、ssr60、ssr64、ssr66、ssr69和ssr70共24个分子标记位点都为栽培稻hy-8基因型(表3中记为b)，ssr6、ssr9、ssr10、ssr11、ssr13、ssr15、ssr32、ssr33、ssr43、ssr52、ssr54、ssr55和ssr57共13个标记位点都为杂合带型(表3中记为h)，ssr4、ssr8、ssr27、ssr28和ssr71共5个标记位点，后代出现分离，但大部分样品都为杂合带型。由此说明，bc3f1群体在ssr6、ssr4、ssr8、ssr9、ssr10、ssr11、ssr13、ssr15、ssr27、ssr28、ssr32、ssr33、ssr43、ssr52、ssr54、ssr55、ssr57和ssr71这18个位点区域带有药用野生稻基因片段(表3中记为杂合带型h)，可将这18个分子标记作为药用野生稻和hy-8杂交后代的进一步选育。实施例2表明，本发明开发的72个ssr分子标记及其ssr引物对，能有效应用于药用野生稻孟定33号和栽培稻hy-8杂交后代的选育中，实施例2中的结果可为孟定33号和hy-8杂交后代的进一步选育提供可靠依据。
[0373]
表3 42个多态性分子标记引物对对21份bc3f1群体材料分型的统计表
[0374]
[0375][0376]
实施例3来自不同的地区的药用野生稻和不同栽培稻品种之间的多态性检测
[0377]
为了进一步明确本发明开发的72个ssr分子标记及其引物对的实用性，实施例3选取72个srr分子标记及其引物对(表1和表2)对如下材料进行检测。同时选用来自云南不同地区的药用野生稻12份：景洪11号、景洪15号、景讷31号、景洪26号、罕宏4号、曼老4号、曼窝2号、孟定28号、勐海7号、勐往71号、勐遮12号和南邻2号；不同的栽培品种12份：细烂地谷、扎昌龙、绿香米、合系35、金刚30、明恢63、日本晴、浙辐7号、ir24、hy-8、02428和93-11作为实验材料。
[0378]
dna提取、pcr扩增和pcr产物检测方法同实施例1。
[0379]
通过上述72对ssr引物对上述12份药用野生稻和12份栽培稻进行ssr检测，结果在24份材料中扩增带型清晰，多态性明显(图2～图13)，反映出了这72个分子标记位点处的药用野生稻与栽培稻之间存在了明显的多态性，根据24份材料的扩增带型，进一步构建24份材料的系统进化树(图14)，从进化树可见，能把24份材料分为两大类，i类主要为药用野生稻，ii类主要为栽培稻，其中明恢63与景洪15号、景讷31号、景洪26号和罕宏4号遗传距离最近，说明明恢63与这4份药用野生稻进行杂交可能较为容易获得杂交后代。本实施例说明本发明开发的72个ssr分子标记及其ssr引物对实用性较强，可有效地用于同时检测药用野生稻与栽培稻多样性，可作为这12份药用野生稻和这12份栽培稻杂交配比的可靠依据，也可进一步用于这12份药用野生稻与这12份栽培稻不同杂交组合的后代群体辅助选育中。
[0380]
特别说明，若参照本实施例或本发明中的方法，都属于本发明的保护范围。