用于HBV相关肝癌早期预警性诊断组合标志物

本发明属生物医学，涉及用于hbv相关肝癌早期预警性诊断组合标志物。

背景技术：

1、据报道，肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，hcc)是造成全球重大疾病负担的恶性肿瘤之一。据估计，肝癌每年导致超过85万的新发病例和超过60万的患者死亡病例。值得注意的是，(hepatitis b virus,hbv)相关肝癌约占肝癌患者总数的70-80％，是肝癌的主要亚型。

2、现代医学研究表明，肝脏部位不具有疼痛反馈机制，即使肝脏出现病变，患者也不会产生任何疼痛不适。这导致肝病缺乏可识别的临床症状，致使60％以上的肝癌患者疾病确诊时已处于疾病晚期，5年生存率低于16％。现阶段，临床上主要采用超声结合甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，afp)检测方法对肝癌疑似患者进行早期筛查。超声检测是一种通过最初成像模式初步判断肝脏表面病变程度的检测方法，这一检测方法高度依赖于医师的临床经验，因此极大地限制了其在肝癌早期筛查中的应用。afp是临床肝癌早期筛查最重要的血清学肿瘤标志物之一，该分子连续升高是肝癌出现的危险标志。但afp作为单一指标，用于肝癌早期筛查的诊断敏感性和特异性均较低。目前高达59％的肝癌患者的afp的检测值仍处于正常水平。美国和欧洲肝病研究协会指南均已不再将afp列为肝癌筛查的硬指标。目前临床缺乏可靠的肝癌诊断生物标志物，临床诊断困难，造成患者治疗延误，预后极差。其中发病率极高的hbv相关肝癌尤为严重，其患者死亡率以每年3％的速度增长。

3、hbv是肝癌最常见的致病因素，也是中国人群肝癌发生的首要原因。据中国家癌症中心统计，我国每年新发肝癌患者约37万人，其中约90％患者伴有hbv感染。hbv感染后会造成机体长期慢性炎症和组织损伤，进而导致肝纤维化/肝硬化，最后导致肝细胞癌的发生。从肝硬化的转变是无症状的，且难以发现。从肝癌发生的疾病进程角度探究促进肝癌发生的关键生物标志物，有助于构建生物标志物与肝脏疾病进程的有效联系，从而赋予生物标志物在肝病进展中的"阶段"性探测属性。hbv感染可通过多种致病机制加剧肝脏疾病的进程，最终导致肝细胞恶性肿瘤的发生。hbx蛋白(hbv x protein,hbx)是hbv感染的关键调控蛋白，在hbv相关肝癌的发生发展中与一系列致癌基因的激活相关。了解hbx介导的下游调控分子，尤其是直接相互作用蛋白，可以从致癌的层面探索和验证促进肝癌发生的生物标志物。

4、随着临床基因检测的普及，医疗研究人员对基因与疾病的关系有了更为准确的认识，从而使基因检测在疾病的早期发现和预防应用中达到前所未有的规模。基因组学和蛋白质组学在检测遗传生物标志物方面的发展为实现肝癌的早期诊断提供了巨大技术支持。在基因组学挖掘参与hbv感染向肝癌转化疾病进程中的关键调控生物标志物的基础上，借助蛋白质组学的co-ip/ms技术，以hbv相关肝癌发生的主要驱动因素hbx的相互作用蛋白的致癌性来验证这些生物标志物，实现肝癌的早期发现和疾病预防，对满足患者对个性化医疗保健和个体化医学预防的需求具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明针对传统早期hbv相关肝癌诊断和治疗中存在的问题，从hbv相关肝癌发生的多阶段特性和主要致癌驱动因素这两个层面提出并验证用于hbv相关肝癌早期诊断的生物标志物组合，可有效构建生物标志物与疾病进程的有效联系，赋予生物标志物在肝病进展中的“阶段”性探测属性，有助于协助临床医生通过早期基因筛查为肝癌高危人群提供个性化诊疗策略。

2、为了实现上述技术问题，本发明提供了一组促进疾病进程由hbv感染向肝癌方向转变的生物标志物，包括:anillin,actin binding protein(anln),cyclin b1(ccnb1),bub1 mitotic checkpoint serine/threonine kinase b(bub1b),epithelial celltransforming 2(ect2),rac gtpase activating protein 1(racgap1),estrogenreceptor 1(esr1),pdz binding kinase(pbk),dna topoisomerase ii alpha(top2a),cyclin dependent kinase 1(cdk1),assembly factor for spindle microtubules(aspm),ribonucleotide reductase regulatory subunit m2(rrm2),nima relatedkinase 2(nek2),protein regulator of cytokinesis 1(prc1),decorin(dcn),insulinlike2growth factor 1(igf1),c-x-c motif chemokine ligand 12(cxcl12),hepatocytegrowth factor(hgf),secreted phosphoprotein 1(spp1),hyaluronan mediatedmotility receptor(hmmr),and denticleless e3ubiquitin protein ligase homolog(dtl)。以上标志物在hbv相关肝癌组织中表达水平高于慢性乙型肝炎患者和hbv相关肝硬化患者，可用于辅助hbv相关肝癌的早期诊断。提供cdk1,rrm2,anln,hmmr与致癌性蛋白hbx存在相互作用证据，均为hbx的下游靶向分子，在hbv相关肝癌的发生进程中有促进和诊断作用，分子的表达量连续升高，是肝癌发生的危险因素。此外，本发明还提供了一系列基于以上关键分子的临床应用效用评估，目的是从多个方面评估癌促分子生物标志物的临床诊断价值。

3、本发明第一方面提供一种生物标志物作为hbv相关肝癌检测、hbv相关预后检测、治疗靶点的用途，其特征在于，所述生物标志物选自anillin,actin binding protein(anln),cyclin b1(ccnb1),bub1 mitotic checkpoint serine/threonine kinase b(bub1b),epithelial cell transforming 2(ect2),rac gtpase activating protein 1(racgap1),estrogen receptor 1(esr1),pdz binding kinase(pbk),dna topoisomeraseii alpha(top2a),cyclin dependent kinase 1(cdk1),assembly factor for spindlemicrotubules(aspm),ribonucleotide reductase regulatory subunit m2(rrm2),nimarelated kinase 2(nek2),protein regulator of cytokinesis 1(prc1),decorin(dcn),insulin like growth factor 1(igf1),c-x-c motif chemokine ligand 12(cxcl12),hepatocyte growth factor(hgf),secreted phosphoprotein 1(spp1),hyaluronanmediated motility receptor(hmmr),或denticleless e3 ubiquitin protein ligasehomolog(dtl)中的一种或组合。

4、本发明第二方面提供一种hbv相关肝癌检测试剂盒，其特征在于:所述试剂盒中含有能够定量检测anillin,actin binding protein(anln),cyclin b1(ccnb1),bub1mitotic checkpoint serine/threonine kinase b(bub1b),epithelial celltransforming 2(ect2),rac gtpase activating protein 1(racgap1),estrogenreceptor 1(esr1),pdz binding kinase(pbk),dna topoisomerase ii alpha(top2a),cyclin dependent kinase 1(cdk1),assembly factor for spindle microtubules(aspm),ribonucleotide reductase regulatory subunit m2(rrm2),nima relatedkinase 2(nek2),protein regulator of cytokinesis 1(prc1),decorin(dcn),insulinlike growth factor 1(igf1),c-x-c motif chemokine ligand 12(cxcl12),hepatocytegrowth factor(hgf),secreted phosphoprotein 1(spp1),hyaluronan mediatedmotility receptor(hmmr),或denticleless e3ubiquitin protein ligase homolog(dtl)的试剂。

5、优选地，所述试剂盒还联合检测其他肝癌标记物的表达，其中，所述的其他肝癌标记物包括:甲胎蛋白afp、甲胎蛋白异质体afp-l3、血清岩藻糖苷酶afu、硫酸肝素蛋白多糖3gpc3、异常凝血酶原dcp、谷氨酰胺转移酶酶ii或组合。

6、优选地，所述试剂盒含有定量检测anillin,actin binding protein(anln),cyclin b1(ccnb1),bub1 mitotic checkpoint serine/threonine kinase b(bub1b),epithelial cell transforming 2(ect2),rac gtpase activating protein 1(racgap1),estrogen receptor 1(esr1),pdz binding kinase(pbk),dna topoisomeraseii alpha(top2a),cyclin dependent kinase 1(cdk1),assembly factor for spindlemicrotubules(aspm),ribonucleotide reductase regulatory subunit m2(rrm2),nimarelated kinase 2(nek2),protein regulator of cytokinesis 1(prc1),decorin(dcn),insulin like growth factor 1(igf1),c-x-c motif chemokine ligand 12(cxcl12),hepatocyte growth factor(hgf),secreted phosphoprotein 1(spp1),hyaluronanmediated motility receptor(hmmr),或denticleless e3ubiquitin protein ligasehomolog(dtl)的特异性扩增基因引物、特异性识别基因的探针或特异性结合蛋白的抗体或配体。

7、本发明第三方面提供特异性识别anillin,actin binding protein(anln),cyclin b1(ccnb1),bub1 mitotic checkpoint serine/threonine kinase b(bub1b),epithelial cell transforming 2(ect2),rac gtpase activating protein 1(racgap1),estrogen receptor 1(esr1),pdz binding kinase(pbk),dna topoisomeraseii alpha(top2a),cyclin dependent kinase 1(cdk1),assembly factor for spindlemicrotubules(aspm),ribonucleotide reductase regulatory subunit m2(rrm2),nimarelated kinase 2(nek2),protein regulator of cytokinesis 1(prc1),decorin(dcn),insulin like growth factor 1(igf1),c-x-c motif chemokine ligand 12(cxcl12),hepatocyte growth factor(hgf),secreted phosphoprotein 1(spp1),hyaluronanmediated motility receptor(hmmr),或denticleless e3ubiquitin protein ligasehomolog(dtl)的基因或其编码蛋白的试剂的用途，用于制备检测hbv相关肝癌的试剂盒。

8、本发明第四方面提供一种hbv相关肝癌预后试剂盒，其特征在于:所述试剂盒中含有能够定量检测anillin,actin binding protein(anln),cyclin b1(ccnb1),bub1mitotic checkpoint serine/threonine kinase b(bub1b),epithelial celltransforming 2(ect2),rac gtpase activating protein 1(racgap1),estrogenreceptor 1(esr1),pdz binding kinase(pbk),dna topoisomerase ii alpha(top2a),cyclin dependent kinase 1(cdk1),assembly factor for spindle microtubules(aspm),ribonucleotide reductase regulatory subunit m2(rrm2),nima relatedkinase 2(nek2),protein regulator of cytokinesis 1(prc1),decorin(dcn),insulinlike growth factor 1(igf1),c-x-c motif chemokine ligand 12(cxcl12),hepatocytegrowth factor(hgf),secreted phosphoprotein 1(spp1),hyaluronan mediatedmotility receptor(hmmr),或denticleless e3ubiquitin protein ligase homolog(dtl)的试剂。

9、优选地，所述试剂盒还联合检测其他肝癌标记物的表达，其中，所述的其他肝癌标记物包括:甲胎蛋白afp、甲胎蛋白异质体afp-l3、血清岩藻糖苷酶afu、硫酸肝素蛋白多糖3gpc3、异常凝血酶原dcp、谷氨酰胺转移酶酶ii或组合。

10、优选地，所述试剂盒含有定量检测anillin,actin binding protein(anln),cyclin b1(ccnb1),bub1 mitotic checkpoint serine/threonine kinase b(bub1b),epithelial cell transforming 2(ect2),rac gtpase activating protein 1(racgap1),estrogen receptor 1(esr1),pdz binding kinase(pbk),dna topoisomeraseii alpha(top2a),cyclin dependent kinase 1(cdk1),assembly factor for spindlemicrotubules(aspm),ribonucleotide reductase regulatory subunit m2(rrm2),nimarelated kinase 2(nek2),protein regulator of cytokinesis 1(prc1),decorin(dcn),insulin like growth factor 1(igf1),c-x-c motif chemokine ligand 12(cxcl12),hepatocyte growth factor(hgf),secreted phosphoprotein 1(spp1),hyaluronanmediated motility receptor(hmmr),或denticleless e3ubiquitin protein ligasehomolog(dtl)的特异性扩增基因引物、特异性识别基因的探针或特异性结合蛋白的抗体或配体。

11、本发明第五方面提供特异性识别anillin,actin binding protein(anln),cyclin b1(ccnb1),bub1 mitotic checkpoint serine/threonine kinase b(bub1b),epithelial cell transforming 2(ect2),rac gtpase activating protein 1(racgap1),estrogen receptor 1(esr1),pdz binding kinase(pbk),dna topoisomeraseii alpha(top2a),cyclin dependent kinase 1(cdk1),assembly factor for spindlemicrotubules(aspm),ribonucleotide reductase regulatory subunit m2(rrm2),nimarelated kinase 2(nek2),protein regulator of cytokinesis 1(prc1),decorin(dcn),insulin like growth factor 1(igf1),c-x-c motif chemokine ligand 12(cxcl12),hepatocyte growth factor(hgf),secreted phosphoprotein 1(spp1),hyaluronanmediated motility receptor(hmmr),或denticleless e3ubiquitin protein ligasehomolog(dtl)的基因或其编码蛋白的试剂的用途，用于制备hbv相关肝癌预后试剂盒。

12、本发明所述hbv相关肝癌优选地为hbv相关肝细胞癌。

13、本发明通过以下流程图得到上述15个hbv相关肝癌的诊断分子标志物。采用两种技术手段来识别gse121248数据集中的差异表达基因(degs)。在degs中构建ppi网络，利用“cytoscape”软件提取ppi网络中的关键枢纽基因(hub genes)。使用tcga数据库分析了hubgenes在肝癌中的表达水平，分析hub genes基因间的相关性，并对hub genes进行了富集分析。采用geo数据库的gse10143、gse25097、gse54236和gse17548数据集分析hub genes在肝硬化向肝癌疾病进程转变过程中的表达趋势。采用cox回归分析建立风险预测模型。基于蛋白质组学，采用co-ip/ms/ms方法探究与hbx有相互作用的关键蛋白。图1为描述本研究的总体框架和方法的流程图。