一类靶向促甲状腺素受体的核酸适配体及其应用

本发明属于分子生物学与临床医学领域，涉及一种靶向促甲状腺素受体的核酸适配体序列及其在制备诊断和治疗graves’病，甲状腺相关性眼病，甲状腺癌等促甲状腺素受体参与发病机制的疾病的药物或者制剂中的应用。

背景技术：

1、促甲状腺素受体属于一种g蛋白偶联受体，其可以接受促甲状腺素的刺激，从而激活下游信号通路的传递。促甲状腺素受体主要表达于甲状腺上皮细胞，在病理情况下，促甲状腺素受体也可以表达与血液中纤维细胞和眼眶内成纤维细胞，例如graves’病、甲状腺相关性眼病等。

2、甲状腺相关性眼病是最常见的成人眼眶疾病，其临床表现复杂多样，包括眼睑退缩、眼球突出等。目前有关甲状腺相关性眼病的治疗方式主要包括药物治疗、放射治疗和手术治疗。常用的一线药物治疗主要包括糖皮质激素、补硒治疗等，然而由于缺少明确的治疗靶点，传统的药物治疗通常具有较明显的副作用。甲状腺相关性眼病发病机制复杂，目前认为其主要与免疫系统的紊乱有关。cd34阳性眼眶成纤维细胞作为一种在甲状腺相关性眼病发病过程中出现的细胞，其主要来源于循环中的纤维细胞，通过趋化因子相互作用进入眼眶内。cd34阳性眼眶成纤维细胞表达大量促甲状腺素受体，在促甲状腺素受体抗体的刺激下可增殖分化并引起一系列眼眶组织病理改变。

3、核酸适配体作为一种单链dna，可以在静电作用力，氢键等多种相互作用力的情况下形成自身卷曲形成复杂的三维结构，并且通过分子间作用力与靶点结合。由于核酸适配体具有化学合成简便、亲和力高、稳定性高和易于编辑等特性被广泛用于检测和靶向药物合成领域中。核酸适配体最早是由核糖核苷酸组成，然而由于核糖核苷酸链易于被降解和不稳定的缺点，目前核酸适配体更多地是由脱氧核糖核苷酸构成。针对蛋白质的核酸适配体筛选基于指数富集配体系统进化技术(selex)，筛选得到的核酸适配体能够特异性地识别正向筛选靶点，并引起靶点参与的信号通路的调节。由于靶点明确，筛选得到的核酸适配体可以针对不同细胞和组织中表达的相同靶点进行识别，能够用于靶点的检测和针对靶点的治疗。

4、目前针对促甲状腺素受体尚无特异性核酸适配体，通过selex技术筛选出特异性识别促甲状腺素受体的核酸适配体，对于促甲状腺素受体的靶向检测和针对促甲状腺素受体的治疗具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供特异性高、亲和性强、稳定性好和实用性广的靶向促甲状腺素受体的核酸适配体及其应用。

2、为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

3、一类靶向促甲状腺素受体的核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列如seq idno:1～seq id no:6中的任意一条或几条序列所示；或者在seq id no:1～seq id no:6中的任意一条序列的基础上进行化学修饰、化学标记或碱基的改变后获得的具有相同功能的核酸适配体的衍生物。

4、其中，seq id no:1：

5、cacgcataacatttcgggggactgctcgggattgcggatacgatgtgttatgcgtg；

6、seq id no:2：

7、cacgcataacttagcgggggactgctcgggattgcggatacgatgtgttatgcgtg

8、seq id no:3：aacatttcgggggactgctcgggattgcggatacgatgtgtt；

9、seq id no:4：atttcgggggactgctcgggattgcggatacgat；

10、seq id no:5：ttagcgggggactgctcgggattgcggatacgat；

11、seq id no:6：ttagcgggggactgctcgggattg。

12、优选的，上述化学修饰或碱基的改变包括磷酸化、甲基化、氨基化、羧基化、巯基化或同位素化中的一种或几种。

13、优选的，上述化学标记包括生物素、亲和素、荧光基团、放射性物质、地高辛、酶、抗体、蛋白、多肽、高分子、纳米发光材料或其他任何治疗性物质中的一种或几种。

14、优选的，上述核酸适配体的核苷酸序列与seq id no:1～seq id no:6中的任意一条序列的同源性在60％以上。

15、本
技术实现要素：
还包括一种与所述的核苷酸序列seq id no:1～seq id no:6中的任意一条序列的同源性在60％以上的核苷酸序列。

16、优选的，所述核苷酸包括核糖核苷酸和肽核酸。

17、本发明内容还包括一种用于检测和诊断与促甲状腺素受体相关的疾病的试剂盒，包含所述的核酸适配体或所述核苷酸序列。

18、优选的，所述与促甲状腺素受体相关的疾病包括graves’病、甲状腺相关性眼病、甲状腺癌。

19、本发明内容还包括一种分子探针，包含所述的核酸适配体或所述核苷酸序列。

20、本发明内容还包括所述的核酸适配体或所述核苷酸序列在诊断试剂、分子影像探针或者靶向介质中的应用。

21、本发明内容还包括所述的核酸适配体或所述核苷酸序列在设计和制备检测、诊断和治疗与促甲状腺素受体相关的疾病的制剂中的应用。

22、本发明采用指数富集配体系统进化技术，通过设计促甲状腺素受体与羧基磁珠结合形成正筛靶标，以结合bsa蛋白质的羧基磁珠为负筛靶标，通过6轮指数富集配体系统进化技术筛选并通过高通量测序技术和表面等离子共振技术验证，得到了能够与促甲状腺素受体特异性结合的核酸适配体序列。

23、本发明通过分子克隆技术、病毒载体和蛋白纯化技术获得促甲状腺素受体蛋白，通过高通量测序技术鉴定适配体文库中的序列。

24、合成高通量测序结果中的核酸适配体，通过表面等离子共振技术鉴定核酸适配体与促甲状腺素受体的亲和性，通过nupack软件获取目标核酸适配体的二级结构，对核酸适配体进行截短优化，通过表面等离子共振技术比较不同的截短优化后的序列与促甲状腺素受体的亲和力，通过流式细胞术检测核酸适配体对于促甲状腺素受体结合的特异性，并检测核酸适配体的血清稳定性，应用核酸适配体在不同温度下检测促甲状腺素受体，并应用核酸适配体检测graves’病、甲状腺相关性眼病患者血液纤维细胞和眼眶成纤维细胞中表达tshr的表达量。

25、本发明的有益效果为：

26、本发明所涉及的核酸适配体具有亲和性高、特异性强、分子量小、稳定性好、合成简单、成本低、易修饰、无免疫原性等优点，可满足目前促甲状腺素受体快速检测的要求。本发明中的各条适配体均能在30min内与靶细胞稳定结合，而不与其他细胞结合。通过对该核酸适配体进行适当的修饰或者标记，可用于促甲状腺素受体参与发病机制的疾病的快速检测和诊断。综上所述，本发明所涉及的新dna核酸适配体对促甲状腺素受体的临床检测、诊断都具有非常重要的意义。

技术特征：

1.一类靶向促甲状腺素受体的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列如seq id no:1～seq id no:6中的任意一条或几条序列所示；或者在seq id no:1～seqid no:6中的任意一条序列的基础上进行化学修饰、化学标记或碱基的改变后获得的具有相同功能的核酸适配体的衍生物；

2.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，所述化学修饰或碱基的改变包括磷酸化、甲基化、氨基化、羧基化、巯基化或同位素化中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，所述化学标记包括生物素、亲和素、荧光基团、放射性物质、地高辛、酶、抗体、蛋白、多肽、高分子、纳米发光材料或其他任何治疗性物质中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列与seq id no:1～seq id no:6中的任意一条序列的同源性在60％以上。

5.一种与核苷酸序列seq id no:1～seq id no:6中的任意一条序列的同源性在60％以上的核苷酸序列。

6.一种用于检测和诊断与促甲状腺素受体相关的疾病的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1-4任一项所述的核酸适配体或如权利要求5所述核苷酸序列。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述与促甲状腺素受体相关的疾病包括graves’病、甲状腺相关性眼病、甲状腺癌。

8.一种分子探针，其特征在于，包含如权利要求1-4任一项所述的核酸适配体或如权利要求5所述核苷酸序列。

9.如权利要求1-4任一项所述的核酸适配体或如权利要求5所述核苷酸序列在诊断试剂、分子影像探针或者靶向介质中的应用。

10.如权利要求1-4任一项所述的核酸适配体或如权利要求5所述核苷酸序列在设计和制备检测、诊断和治疗与促甲状腺素受体相关的疾病的制剂中的应用。

技术总结
本发明涉及一类靶向促甲状腺素受体的核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:6中的任意一条或几条序列所示；或者在SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:6中的任意一条序列的基础上进行化学修饰、化学标记或碱基的改变后获得的具有相同功能的核酸适配体的衍生物。本发明所涉及的核酸适配体具有亲和性高、特异性强、分子量小、稳定性好、合成简单、成本低、易修饰、无免疫原性等优点，可满足目前促甲状腺素受体快速检测的要求。

技术研发人员：熊炜,曹家敏,张凤,谢冰雨
受保护的技术使用者：中南大学湘雅三医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12