一种用于薏苡品种鉴定的SSR引物组合及其鉴定方法与流程

本发明涉及分子标记，具体涉及一种用于薏苡品种和/或种质资源鉴定的ssr引物组合及其鉴定方法。

背景技术：

1、薏苡是我国传统药食兼用作物，南北均可种植，贵州不仅是我国薏苡主产区，也是全国最大的薏苡加工集聚区和产品集散地，来自全国的薏苡品种在贵州种植、加工、汇集和流通，易造成品种混杂、张冠李戴，给市场监管带来了极大的挑战。另外，随着人们对健康饮食的注重，薏苡作为营养丰富的小杂粮受到市场推崇，不同地区的薏苡种质资源交流频繁、品种选育力度加大，品种登记数量逐年急剧增多，不仅出现同名异种现象，同时派生系或衍生系品种增多，给品种管理带来困难。再者，薏苡自然异交率为35.9％-72.8％，繁种过程中即使严格控制条件，也难免会有一定数量的杂株出现，影响种子生产的纯度。综上所述，需要一套科学、准确、可操作的品种鉴定方法为薏苡种业管理和市场监管提供依据。

2、目前，薏苡品种的鉴定主要依靠田间表型，但很多农艺性状受微效多基因控制，易受环境条件的影响，出现品种误判情况，利用分子标记在基因组水平上进行检测可以满足薏苡品种鉴定和种子检测效率高和准确性高的内在需求。ssr标记变异丰富、遗传稳定，是农作物种质资源评价和品种鉴定的主要分子标记之一，但是对于薏苡品种来说，尚无可用标记，也未建立分子检测方法。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的之一在于提供一种用于薏苡品种鉴定的ssr分子标记；本发明的目的之二在于提供一种用于薏苡品种鉴定的引物组合；本技术的目的之三在于提供一种用于薏苡品种鉴定的试剂盒；本技术的目的之四在于提供一种薏苡品种的鉴定方法；本技术的目的之五在于提供所述ssr分子标记、所述引物组合、所述试剂盒、或者所述鉴定方法的应用。本发明的引物组合鉴别能力强，可以鉴别几乎所有薏苡品种，特别是可以将231个薏苡种质资源区分开，能够用于鉴定未知品种是否属于231种薏苡种质资源之一，还能鉴定任意两个未知的薏苡品种是否属于相同或近似品种。

2、为实现上述目的，本发明的技术方案为：

3、第一方面，本发明提供一种用于薏苡品种和/或种质资源鉴定的ssr分子标记，所述分子标记包括如下30个分子标记中的一种或多种：

4、cl02_gag9_138，位于薏苡参考基因组中ncbi genbank cm019822.1所述序列的第18275142-18275168位；cl02_tct13_159，位于薏苡参考基因组中ncbi genbankcm019822.1所述序列的第49134490-49134531位；cl01_gac9_6，位于薏苡参考基因组中ncbi genbank cm019823.1所述序列的第179895861-179895878位；cl01_cga14_18，位于薏苡参考基因组中ncbi genbank cm019823.1所述序列的第162400083-162400120位；cl03_aag9_237，位于薏苡参考基因组中ncbi genbank cm019824.1所述序列的第178887434-178887460位；cl 03_tgt11_246，位于薏苡参考基因组中ncbi genbank cm019824.1所述序列的第168855678-168855710位；cl03_caa10_281，位于薏苡参考基因组中ncbi genbankcm019824.1所述序列的第48421460-48421489位；cl03_cttg7_310，位于薏苡参考基因组中ncbi genbank cm019824.1所述序列的第112812150-112812173位；cl04_tat11_324，位于薏苡参考基因组中ncbi genbank cm019825.1所述序列的第1845079-1845111位；cl04_tta10_355，位于薏苡参考基因组中ncbi genbank cm019825.1所述序列的第55294636-55294665位；cl04_tga14_377，位于薏苡参考基因组中ncbi genbank cm019825.1所述序列的第127661701-127661743位；cl04_atg11_402，位于薏苡参考基因组中ncbi gen bankcm019825.1所述序列的第158437947-158437973位；cl05_tga9_503，位于薏苡参考基因组中ncbi genbank cm019826.1所述序列的第159792618-159792641位；cl05_atc15_493，位于薏苡参考基因组中ncbi genbank cm019826.1所述序列的第144746297-144746329位；cl05_tcta9_512，位于薏苡参考基因组中ncbi genbank cm019826.1所述序列的第42693057-42693113位；cl06_gaa16_547，位于薏苡参考基因组中ncbi genbankcm019827.1所述序列的第118744609-118744646位；cl08_tat10_727，位于薏苡参考基因组中ncbi genbank cm019828.1所述序列的第18531746-18531775位；cl08_cat9_739，位于薏苡参考基因组中ncbi genbank cm019828.1所述序列的第50140563-50140589位；cl08_cat9_740，位于薏苡参考基因组中ncbi genbank cm019828.1所述序列的第50144777-50144803位；cl08_tag9_716，位于薏苡参考基因组中ncbi genbank cm019828.1所述序列的第2217115-2217142位；cl08_ctt13_776，位于薏苡参考基因组中ncbi genbankcm019828.1所述序列的第146977378-146977440位；cl08_atc22_749，位于薏苡参考基因组中ncbi genbank cm019828.1所述序列的第104139096-104139168位；cl10_tca10，位于薏苡参考基因组中ncbi genbank cm019829.1所述序列的第114715781-114715810位；cl10_tta10_895，位于薏苡参考基因组中ncbi genbank cm019829.1所述序列的第17981504-17981530位；cl10_gga13_885，位于薏苡参考基因组中ncb i genbank cm019829.1所述序列的第10100327-10100341位；cl10_cca9_879，位于薏苡参考基因组中ncbi genbankcm019829.1所述序列的第2510104-2510137位；cl07_aag9_626，位于薏苡参考基因组中ncbi genbank cm019831.1所述序列的第1221177-1221203位；cl07_atg15_667，位于薏苡参考基因组中ncbi genbank cm019831.1所述序列的第71338383-71338424位；cl07_cat10_669，位于薏苡参考基因组中ncbi genbank cm019831.1所述序列的第75083331-75083351位；cl07_atag7_698，位于薏苡参考基因组中ncbi genbank cm019831.1所述序列的第28068144-28068161位。

5、第二方面，本发明提供一种用于薏苡品种和/或种质资源鉴定的引物组合，所述引物组合包括如下30个引物对中的一种或多种：

6、cl02_gag9_138fr、cl02_tct13_159fr、cl01_gac9_6fr、cl01_cga14_18fr、cl03_aag9_237fr、cl03_tgt11_246fr、cl03_caa10_281fr、cl03_cttg7_310fr、cl04_tat11_324fr、cl04_tta10_355fr、cl04_tga14_377fr、cl04_atg11_402fr、cl05_tga9_503fr、cl05_atc15_493fr、cl05_tcta9_512fr、cl06_gaa16_547fr、cl08_tat10_727fr、cl08_cat9_739fr、cl08_cat9_740fr、cl08_tag9_716fr、cl08_ctt13_776fr、cl08_atc22_749fr、cl10_tca10fr、cl10_tta10_895fr、cl10_gga13_885fr、cl10_cca9_879fr、cl07_aag9_626fr、cl07_atg15_667fr、cl07_cat10_669fr、cl07_atag7_698fr；

7、其中，引物对cl02_gag9_138fr用于扩增所述cl02_gag9_138，其序列如seq idno:1和seq id no:2所示；引物对cl02_tct13_159fr用于扩增所述cl02_tct13_159，其序列如seq id no:3和seq id no:4所示；引物对cl01_gac9_6fr用于扩增所述cl01_gac9_6，其序列如seq id no:5和seq id no:6所示；引物对cl01_cga14_18fr用于扩增所述cl01_cga14_18，其序列如seq id no:7和seq id no:8所示；引物对cl03_aag9_237fr用于扩增所述cl03_aag9_237，其序列如seq id no:9和seq id no:10所示；引物对cl03_tgt11_246fr用于扩增所述cl03_tgt11_246，其序列如seq id no:11和seq id no:12所示；引物对cl03_caa10_281fr用于扩增所述cl03_caa10_281，其序列如seq id no:13和seq id no:14所示；引物对cl03_cttg7_310fr用于扩增所述cl03_cttg7_310，其序列如seq id no:15和seq idno:16所示；引物对cl04_tat11_324fr用于扩增所述cl04_tat11_324，其序列如seq id no:17和seq id no:18所示；引物对cl04_tta10_355fr用于扩增所述cl04_tta10_355，其序列如seq id no:19和seq id no:20所示；引物对cl04_tga14_377fr用于扩增所述cl04_tga14_377，其序列如seq id no:21和seq id no:22所示；引物对cl04_atg11_402fr用于扩增所述cl04_atg11_402，其序列如seq id no:23和seq id no:24所示；引物对cl05_tga9_503fr用于扩增所述cl05_tga9_503，其序列如seq id no:25和seq id no:26所示；引物对cl05_atc15_493fr用于扩增所述cl05_atc15_493，其序列如seq id no:27和seq id no:28所示；引物对cl05_tcta9_512fr用于扩增所述cl05_tcta9_512，其序列如seq id no:29和seq id no:30所示；引物对cl06_gaa16_547fr用于扩增所述cl06_gaa16_547，其序列如seqid no:31和seq id no:32所示；引物对cl08_tat10_727fr用于扩增所述cl08_tat10_727，其序列如seq id no:33和seq id no:34所示；引物对cl08_cat9_739fr用于扩增所述cl08_cat9_739，其序列如seq id no:35和seq id no:36所示；引物对cl08_cat9_740fr用于扩增所述cl08_cat9_740，其序列如seq id no:37和seq id no:38所示；引物对cl08_tag9_716fr用于扩增所述cl08_tag9_716，其序列如seq id no:39和seq id no:40所示；引物对cl08_ctt13_776fr用于扩增所述cl08_ctt13_776，其序列如seq id no:41和seq id no:42所示；引物对cl08_atc22_749fr用于扩增所述cl08_atc22_749，其序列如seq id no:43和seq id no:44所示；引物对cl10_tca10fr用于扩增所述cl10_tca10，其序列如seq id no:45和seq id no:46所示；引物对cl10_tta10_895fr用于扩增所述cl10_tta10_895，其序列如seq id no:47和seq id no:48所示；引物对cl10_gga13_885fr用于扩增所述cl10_gga13_885，其序列如seq id no:49和seq id no:50所示；引物对cl10_cca9_879fr用于扩增所述cl10_cca9_879，其序列如seq id no:51和seq id no:52所示；引物对cl07_aag9_626fr用于扩增所述cl07_aag9_626，其序列如seq id no:53和seq id no:54所示；引物对cl07_atg15_667fr用于扩增所述cl07_atg15_667，其序列如seq id no:55和seq id no:56所示；引物对cl07_cat10_669fr用于扩增所述cl07_cat10_669，其序列如seq id no:57和seq id no:58所示；引物对cl07_atag7_698fr用于扩增所述cl07_atag7_698，其序列如seqid no:59和seq id no:60所示。

8、在上述用于薏苡品种和/或种质资源鉴定的引物组合中，作为一种优选实施方式，所述各引物对中，上游引物的5’端连有荧光标签；优选地，所述荧光标签选自fam或hex。

9、第三方面，本发明提供一种包含上述引物组合的试剂盒。

10、第四方面，本发明提供一种薏苡品种和/或种质资源的鉴定方法，所述方法包括以下步骤：

11、s1、取一份待测样品，提取待测样品的总dna；

12、s2、取步骤s1制得的总dna为模板，采用上述引物组合分别对所述总dna模板进行pcr扩增，制得各组pcr扩增产物；

13、s3、根据步骤s2制得的各组pcr扩增产物分析其对应的ssr位点的基因型，当待测样品的基因型与已知薏苡品种和/或种质资源基于所述30个ssr位点的基因型差异位点数为0-2个时，判定待测样品与已知薏苡品种和/或种质资源为相似或相同的品种和/或种质资源；当待测样品的基因型与已知薏苡品种和/或种质资源基于所述30个ssr位点的基因型差异位点数大于2个时，判定待测样品与已知薏苡品种和/或种质资源为不同品种和/或种质资源。

14、在上述薏苡品种和/或种质资源的鉴定方法中，作为一种优选实施方式，根据步骤s2制得的各组pcr扩增产物分析其对应的ssr位点的基因型的方法为：对各组pcr扩增产物分别进行电泳和/或测序；优选地，所述电泳为毛细管电泳或聚丙烯凝胶电泳。

15、在上述薏苡品种和/或种质资源的鉴定方法中，作为一种优选实施方式，所述已知薏苡品种选自以下21个薏苡品种：

16、贵州品种：贵薏苡1号、黔薏苡1号、黔薏2号、薏珠2号、薏珠3号、安薏1号、滇东北薏苡；云南品种：文薏2号、文薏3号、文薏4号、文薏5号；浙江品种：浙薏1号；福建品种：金沙薏苡、师薏1号、蒲薏6号；安徽品种：皖薏1号、皖薏2号；河北品种：冀薏1号、祁薏苡；广西品种：桂薏1号；四川品种：大黑山薏苡。

17、在上述薏苡品种和/或种质资源的鉴定方法中，作为一种优选实施方式，所述已知薏苡种质资源选自以下231个薏苡种质资源：

18、安徽种质资源1、福建种质资源2、广西种质资源5、7、8、9、12、13、14、15、16、19、20、21、22、23、24、26、27、28、29、31、32、33、34、35、36、37、38、41、42、43、47、48-1、49-1、49-2、50、53、54、357、361、412、g x011、675、676，贵州种质资源57、59、60、61、63、64、65、66、67、68、69、74、76、79、82、87、90、93、95、101、105、107-2、112、113、115、117、121、122、125、127、128、337、338、340、341、353、365、366、367、372、394-1、395、402-1、406、407、410、427、429、431、434-1、439-2、443、446、453、454、456、458、465、469、474、481、484、561、574、430、bd、湖北种质资源hu001，湖南种质资源131、135、522，江苏种质资源137、138、146、148、672，老挝种质资源669和l2，山东种质资源202和sd-3，四川种质资源182、184、185、186、188、189-1、189-2、190、191-1、192-4、193、194、195、198、383、384、391、392-2、542、671、sc-16，越南种质资源yuen-31，云南种质资源203、205、208、209、210、211、212、213、215、217、219、221、223-1、223、224、225、226、227、229、232、233-6、235、236、238、242、243、247、248、251、253、255、256、257、258、261、262、267、270、271、272、272-3、278、279、281、282、287、288、289、296-2、297、298、306-1、308、312、313、315、343、378、393、418、500、y166，yn-10，234，浙江种质资源321、323、326、334、zj-27，其他来源的种质资源159、164、171、178、354、597-2、601、607、609、625、631、633-3、635、655、661、y305。

19、在上述薏苡品种和/或种质资源的鉴定方法中，作为一种优选实施方式，所述pcr扩增的反应体系中，上游引物和下游引物的浓度均为250μm，缓冲液浓度为1×pcr buffer，dntp的浓度为50μm，mgcl2的浓度为2mm，taq酶的浓度为0.02u/μl，dna模板的浓度为3ng/μl。

20、在上述薏苡品种和/或种质资源的鉴定方法中，作为一种优选实施方式，所述pcr扩增的程序为：预变性94℃2min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共进行30个循环；之后72℃延伸10min。

21、第五方面，本发明提供上述第一方面所述的ssr分子标记、第二方面所述的引物组合、第三方面所述的试剂盒、或第四方面所述的鉴定方法在薏苡遗传多态性分析或薏苡辅助育种方面的应用。

22、在上述应用中，作为一种优选实施方式，所述薏苡辅助育种方面的应用为以下x1或x2或x3中的应用：

23、x1：鉴定待测薏苡样品属于已知薏苡品种和/或已知薏苡种质资源中的哪一种；

24、x2：鉴定两份待测薏苡样品是否属于同一品种或同一种质资源；

25、x3：鉴定待测薏苡样品是否属于已知薏苡品种和/或已知薏苡种质资源。

26、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

27、同田间薏苡品种鉴定的方法相比较，本方法具有不受生育期限制、不受环境影响、快速、准确、高效的特点；

28、同其他分子技术鉴定品种的方法相比，本方法基于高通量测序和大数据发掘技术，选出了大量的候选ssr标记，并通过多重条件进行了筛选和优化工作，最终获得了一套可以稳定准确、简单高效的进行薏苡品种鉴定的ssr分子标记，该标记均匀分布于全基因组、多态性高，同其他随机选取的标记位点具有本质区别，同时，本发明使用的数据挖掘方法，所选出的ssr标记可以非常有效的代表全基因组信息，本发明所选出的ssr标记具有非常强的潜在鉴别未知薏苡品种的能力，本研究开发的ssr引物组合及方法在属内不同种、多种类型薏苡种质和几乎所有薏苡品种中进行了检测，具有强的鉴别能力，可以区分和鉴定任意两个未知的薏苡品种是否属于相同或相似品种。