一种申氏不动杆菌SIP23-7及其应用

一种申氏不动杆菌sip23-7及其应用
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种申氏不动杆菌sip23-7及其应用。


背景技术：

2.植物的生长发育需要大量的营养成分，磷是植物生长的主要必需的营养要素之一。通常，会通过施肥来满足植物的营养需求，但施用在土壤上的可溶性磷肥很容易沉淀，植物对磷肥的回收率只有25％左右，导致磷难以被植物所吸收而缺乏，进而严重制约作物生长，无法实现农业的可持续发展。其中解磷菌(phosphorous solubilizing microorganisms，psm)是一个重要亚群，其能将以po
43-形式存在的难溶性磷转化为以hpo
42-和h2po
4-形式存在的植物可吸收利用的可溶性磷，为植物提供更多可用的磷，进而提高了不溶磷的利用率和解磷效率，并促进植物生长，如丛枝菌根真菌arbuscular mycorrhizal fungi(amf)促进植物对磷的吸收。在作物上接种溶磷菌(psb)有可能在不显著降低作物产量的情况下，将磷肥的用量降低50％。因此，研究利用解磷微生物具有十分重要的意义。
3.现有技术中具有解磷促生作用的微生物有醋酸钙不动杆菌(acinetobacter calcoaceticus)等，但是并未见申氏不动杆菌具有解磷促生作用的报道。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种申氏不动杆菌sip23-7及其应用，该申氏不动杆菌sip23-7具有解磷能力、分泌iaa能力、产铁载体能力、产acc脱氨酶能力等。
5.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种申氏不动杆菌(acinetobacter schindleri)，命名为申氏不动杆菌sip23-7，于2021年09月09日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m20211152，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
6.上述申氏不动杆菌sip23-7可用于降解无机磷和/或有机磷。
7.上述申氏不动杆菌sip23-7可用于制备含嗜铁素的制剂。
8.上述申氏不动杆菌sip23-7可用于制备iaa制剂。
9.上述申氏不动杆菌sip23-7可用于促进植物生长，优选促进玉米生长。
10.上述申氏不动杆菌sip23-7可用于制备解磷促生生物菌剂或解磷促生生物肥料。
11.一种降解无机磷和/或有机磷制剂，包括上述申氏不动杆菌sip23-7。
12.一种含嗜铁素的制剂，包括上述申氏不动杆菌sip23-7。
13.一种iaa制剂，包括上述申氏不动杆菌sip23-7。
14.一种促进植物生长的制剂，包括上述申氏不动杆菌sip23-7。
15.一种解磷促生生物菌剂，包括上述申氏不动杆菌sip23-7，还可以将该菌剂制备成解磷促生生物肥料。
16.上述应用或制剂中，申氏不动杆菌sip23-7可以固体形式存在也可以以发酵液等
形式存在，其存在形式均不影响其发挥作用。
17.本发明具有以下有益效果：
18.本发明从苦参根际土壤中分离出一株具有解磷能力的菌株，通过形态学、生理生化和分子生物学等方面对该菌株进行鉴定，该菌株属于不动杆菌属(acinetobacter sp.)，与申氏不动杆菌acinetobacter schindleri strain luh5832的16s ribosomal rna序列相似性最高(99％)，将其命名为sip23-7，同时对其解磷能力、分泌iaa能力，产铁载体能力等促生特性进行测定，并以玉米为研究材料，将解磷菌sip23-7配制成菌剂研究对玉米幼苗生长的影响。通过测定玉米幼苗的株高，茎粗，叶面积、根长、根粗等形态指标以及地上鲜重、地上干重、地下鲜重、地下干重、根系活力等生理生化指标，与对照组ck作对比，经浇菌剂sip23-7处理后的玉米，除茎粗和地上干重外，其他指标都有不同程度的增长，尤其地下干重比对照组增长了275％，这为农作物提供一种潜在的溶磷生物菌肥，采用包含该菌剂的微生物肥料，可提高作物的产量及品质，改善土壤环境，有助于农业的可持续发展。
附图说明
19.图1为菌落形态和电镜观察结果。
20.图2为菌株生长曲线图。
21.图3为菌株生理生化鉴定结果。
22.图4为基于16s rdna基因序列构建的菌株系统发育树。
23.图5为菌株sip23-7解磷能力测定结果。
24.图6为菌株sip23-7接种于无机磷培养基后上清液中可溶性磷含量变化结果。
25.图7为菌株sip23-7接种于无机磷培养基后上清液ph值变化结果。
26.图8为菌株sip23-7嗜铁能力定性测定结果。
27.图9为ttf标准曲线。
28.图10为不同处理的玉米幼苗根系生长图。
具体实施方式
29.以下所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
30.实施例1：菌株的筛选和鉴定
31.一、菌株筛选
32.从“山西省振东道地药材开发有限公司”苦参种植基地，称取5g苦参根际土壤，加入无菌水，于28℃，摇床150r/min，震荡30min，使其充分混匀，并相应稀释成10-3
，10-4
，10-5
，10-6
各梯度，选取每个梯度涂布在有机磷固体培养基(蒙金娜培养基)上，于28℃恒温培养箱培养4d。后经过三代划线得到解磷菌的单菌落，用无菌的牙签挑取单一菌落，于25％的甘油中，在-80℃冰箱进行保存。
33.二、菌株鉴定
34.1、菌株形态学和生理生化鉴定
35.(1)菌株形态学鉴定
36.将筛选的菌株接种于lb固体培养基中，于28℃培养3-4d，观察菌落的颜色、形状、大小等特征，具体结果见图1，菌株生长曲线见图2。
37.由图1可知，菌落形态为球状，菌落较小，中间凸起，表面光滑，不透明。
38.(2)菌株生理生化鉴定
39.参照《常见细菌系统鉴定手册》和《微生物学实验技术》中测定细菌的生理生化特征，对解磷菌进行革兰氏染色试验、明胶液化试验、丙二酸盐试验、柠檬酸盐试验、甲基红试验、过氧化氢酶试验、伏普(v-p)试验、苯丙氨酸脱氨酶试验。
40.鉴定结果：菌株为革兰氏阴性菌，伏普、甲基红、明胶液化、苯丙氨酸脱氨酶、吲哚实验、淀粉水解及尿素酶实验均为阴性；丙二酸盐、柠檬酸盐和卵磷脂实验为阳性，部分实验结果见图3。
41.2、菌株的分子生物学鉴定及系统发育分析
42.提取菌株基因组dna，利用细菌通用引物扩增16s rdna，引物序列如下：
43.27-f:5
’‑
agagtttgatcctggctcag-3’，
44.1492-r:5
’‑
ggttaccttgttacgactt-3’。
45.pcr扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸2min，35个循环；最后72℃延伸10min。pcr产物纯化后送至北京华大科技公司测序，序列经ncbi同源序列blast比对分析，结果利用mega 7.0软件分析，用邻接法(neighbor-joining，nj)，采用kimura2-parameter作为模型，复制(bootstrap replication)1000次，检验模型稳定性，绘制系统发育树。
46.鉴定结果：对菌株16s rdna进行扩增后，扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，其大小均为1.5kb的单一条带，经克隆后测得的序列在ncbi数据库中进行比对。由图4可知，菌株在系统发育上属于不动杆菌属(acinetobacter sp.)，与申氏不动杆菌acinetobacter schindleri strain luh5832的16s ribosomal rna序列相似性最高(99％)，将该菌株命名为acinetobacter sp.sip23-7(申氏不动杆菌sip23-7)，于2021年09月09日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m20211152，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
47.实施例2：菌株的促生能力测定
48.一、菌株sip23-7解磷能力的测定
49.将蒙金娜有机磷固体培养基平均分成四个区域，将已筛选得到的菌株sip23-7的新鲜菌液在每个区域滴加1μl，点接种；放于28℃培养箱培养；根据平板上长出的溶磷圈直径(d)/菌落直径(d)的比值(见表1)，进行初步判断解磷菌的解磷能力，具体见图5，图5a和图5b分别为不接菌培养基与接种sip23-7菌株培养基。
50.由图5可知，将菌株sip23-7通过点接种于有机磷固体培养基中，培养4d后可观察到菌落周围呈现透明圈，表明菌株sip23-7具有解磷能力。
51.二、菌株sip23-7解无机磷的解磷动力学
52.将菌株sip23-7种子液按1％的接种量接种于50ml以磷酸钙为唯一磷源的nbrip液体培养基中，28℃，180r/min振荡培养9d，每隔24h取3组重复，以不接菌的空白培养基作为对照，按上述操作方法测定上清液的可溶性磷含量和ph值，具体结果见图6和图7。
53.由图6可知，随着培养天数的增加，固定在培养瓶底部的磷酸钙固体越来越小，最后消失。
54.由图7可知，随着培养天数的增加，菌株浓度逐渐增加，而ph值先降低，然后维持在较稳定的状态。
55.三、解钾能力测定
56.挑取菌株sip23-7点接于钾长石固体培养基平板上，28℃倒置培养3-4d后，观察解钾圈的情况。
57.同时记录并计算溶解钾圈直径和菌落直径的比值(d/d)为5.33(见表1)，可以初步判断菌株sip23-7具有解钾能力。
58.四、菌株sip23-7产嗜铁素能力的测定
59.嗜铁能力定性测定：将菌株sip23-7点接在cas固体培养基中央，置于30℃恒温培养箱中72h，如果菌株周边出现黄绿色晕圈，说明该菌株具有产嗜铁素的能力。
60.嗜铁能力定量测量：将菌株按1：100的量接入到30ml mkb液体培养基中；28℃、200r/min摇床培养24h；离心(10000r/min，10℃)15min，取上清液与等体积cas蓝色检测液混匀；以不接菌的mkb培养液作对照，25℃下放置1h后，测定菌株23-7(t)与不接菌的空白对照(ck)od
630
的值，用如下公式计算铁载体产量(结果见表1)：
[0061][0062]
测定结果：菌株sip23-7周边出现黄绿色晕圈，说明菌株sip23-7具有产嗜铁素的能力(具体见图8)。
[0063]
五、菌株sip23-7分泌iaa能力的测定
[0064]
菌株sip23-7分泌iaa能力的测定方法参照《中华补血草内生与根际具acc脱氨酶活性细菌的筛选及其生物多样性》(冯维维等,微生物学报，2016)，具体过程如下：
[0065]
产生长素iaa定性检测：参照salkowski比色法，在含有色氨酸的培养基中培养7d后与显色剂混匀，室温显色2min，如果出现粉红色则为阳性，说明能够产iaa。
[0066]
产生长素iaa定量检测：将菌株接种于无菌的有氮培养基(含0.5mg/ml色氨酸)中，于28℃摇床培养7d(不接菌的作为对照)，4000r/min离心，取上清溶液于试管中加入等体积的ri试剂，混匀后避光放置30min，530nm波长条件下测定其od值。通过iaa浓度与od值的关系曲线计算相应的iaa浓度。
[0067]
测定结果：由定性实验可知，菌株sip23-7能够产iaa。通过绘制iaa的标准曲线可得，菌株sip23-7具有产iaa能力，分泌iaa浓度为14.191μg/ml，菌株产iaa可加快植株的生长代谢，促进植株的生长。
[0068]
菌株sip23-7促生能力测定数据具体见表1：
[0069]
表1菌株sip23-7促生能力测定结果
[0070][0071]
实施例3：菌株sip23-7盆栽接种实验
[0072]
实验过程：将甘油保存的菌株sip23-7，按1：100的比例接入液体lb培养基中第一
次活化5～6h，之后，取活化好的菌液500μl，按照1：100的比例接入150ml的锥形瓶中，过夜摇培12h。无菌水洗涤菌体3次，调节菌悬液浓度至108cfu/ml制成菌剂。将菌剂加入240g(60g
×
4)的育苗基质中混匀，对照组(ck)则用等量无菌水代替，然后播种已催芽的玉米种子(种子在播种之前，先用温水浸泡过夜)。栽培基质由腐熟花生皮：蛭石：珍珠岩：鸡蛋壳以50：25：20：5的质量比混合，纱布包裹后，在高压灭菌锅中121℃灭菌2次，分装入育苗盆中，设10个重复，每盆种植2颗玉米；置于温室(25℃)培养，待出苗整齐后每盆定苗1株为大小一致的幼苗。隔3d定量浇一次水，20d后，测定株高、茎粗、地上鲜重、地上干重、地下鲜重、地下干重、根长、根粗等形态指标。
[0073]
玉米幼苗根系活力标准曲线的制作：
[0074]
配制1mg/ml(1％)的ttc溶液，取其2ml于100ml容量瓶中，加入2g na2s2o4摇匀，加入乙酸乙酯40ml震荡至充分溶解，用乙酸乙酯定容，制成ttf标准液(20μg/ml)，制作ttf标准曲线。在485nm波长下测定od值，绘制标准曲线(具体见图9)，求出回归方程如下：
[0075][0076]
待玉米幼苗生长至20d后，将sip23-7菌剂处理组和对照组的玉米幼苗从土样中拔出后清洗干净，参照朱秀云等(朱秀云等，2020)的方法，分别测od
485
的值，带入回归方程式，计算菌剂sip23-7处理组与ck的玉米根系活力。求出ttc的还原量，即为玉米植株的根系活力。
[0077]
数据分析：实验数据使用excel和spss 13.0统计软件进行方差分析和多重比较。采用epson扫描仪获取根系样本，运行winrhizo pro根系分析系统软件，对所获取的根系样本进行分析。
[0078]
实验结果：由表2可知，通过测定经浇菌剂sip23-7的处理组与只浇无菌水对照组的株高、茎粗等多个形态指标比较，经浇菌剂sip23-7的处理组，除茎粗和地上干重外，其他指标都有不同程度的增长，尤其地下干重比对照组增长了275％；结合株高不同处理对玉米幼苗根系形态及根系活力会产生不同程度的影响，如图10所示，sip23-7处理组的根系较ck发达。
[0079]
如表2所示，sip23-7处理组的ttc还原强度高于ck，根据玉米幼苗的根系形态(图10)及根系活力的测定，表明sip23-7菌剂对玉米的处理促进了玉米幼苗的生长。
[0080]
表2不同处理方式的玉米形态指标测定结果
[0081][0082]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。