生产免疫球蛋白G降解酶的工程菌株和工艺的制作方法

生产免疫球蛋白g降解酶的工程菌株和工艺
技术领域
1.本发明属于生物工程领域，具体涉及用于生产一种半胱氨酸水解酶(免疫球蛋白g降解酶)的工程菌株和生产工艺。


背景技术：

2.来自酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)的免疫球蛋白g降解酶(immunoglobulin g-degrading enzyme of spyogenes，ides)是一种典型的半胱氨酸水解酶。ides蛋白酶最初从血清型为m1的a组链球菌菌株中被分离得到。ides蛋白酶具有极高的底物特异性，仅识别igg铰链区的特定位点(ch1结构域和ch2结构域之间)进行切割，以产生f(ab’)2和fc片段。ides蛋白酶能够切割多种动物来源的igg，其底物特异性、切割位点的专一性使其在抗体药物或fc融合蛋白药物的结构解析中得到广泛应用。
3.近年来，ides的酶切特性也得到了开发和利用。例如，基于ides能够切割免疫球蛋白的能力，将ides作为一种免疫抑制剂应用于人类免疫疾病及器官移植等领域。随着用途的扩展，对于ides蛋白酶的高效表达及制备工艺提出了挑战。
4.ides蛋白酶的制备最初利用了其原始生产菌酿脓链球菌，但表达量受到限制。而后，多数学者选择在基因工程常用宿主大肠杆菌表达系统中表达ides蛋白酶。许静等人在“半胱氨酸蛋白酶ides的原核表达、纯化及活性鉴定”(中国生物工程杂志，2014，34(10)：8-14)中，描述了利用双标签(gst及his6)表达系统在大肠杆菌中高效表达可溶性gst-ides-his6的方法，并进行了纯化制备与分析鉴定。在许静的方法中，每1升菌液可获得纯度大于90％的ides蛋白酶25mg，此法的表达水平仍然不高，难以大规模应用。除此之外，分子中所引入的标签使药物的人体应用受到限制，大大增加了免疫原性风险，在生物制药领域的应用通常会受到限制。
5.ides蛋白酶在不同类型的大肠杆菌菌株中表达量差异较大，且由于该分子特性，导致目标表达定位不稳定。而且在不同菌株中，目标蛋白表达量随着菌种代次增加而具有差异性，甚至出现质粒随代次增加而丢失的情况。因此，为了进行ides蛋白酶的大规模生产和应用，首要目标是构建稳定表达目标蛋白酶的菌株，并再此基础上尽可能提高目标表达产量，以满足工艺放大需求。
6.另外一个问题是如何解决ides蛋白酶作为外源蛋白在原核细胞中表达时易形成包涵体。大肠杆菌表达系统与其他外源表达系统相比，具有重组蛋白产量高、易操作、生长速度快和成本低等特点。通过大肠杆菌表达重组蛋白既高效又经济。然而，大肠杆菌是一种原核生物，外源蛋白在大肠杆菌中表达时往往处于还原性环境的胞质中，不易形成二硫键，会出现外源蛋白无法正确折叠的现象，从而形成不可溶的包涵体。如果大量形成了包涵体，则需要在下游进行包涵体变复性的步骤，使得整个制备过程变得繁琐，增加了成本和不确定性。
7.现有的文献报道中描述了一些ides制备方法，这些方法通常利用使表达的ides带有特定标签并利用标签进行亲和纯化。这些方法一般仅关注目标ides的纯度和活性，较少
进行关于宿主杂质残留、与安全性相关的内毒素控制、无菌性等的研究。
8.在蛋白生物药的商业化过程中，对于直接注射入人体的蛋白药物而言，通常会选择利用其天然结构且不引入标签，从而降低潜在的免疫原性及对活性的影响。因此，需要开发一种不基于标签的目的蛋白下游纯化方法，并获得理化特性和安全性均合格的产品。
9.现在亟需一种能够降低ides蛋白酶的包涵体比例的生产菌株配套的发酵、纯化工艺，以提高ides蛋白酶在大肠杆菌中的可溶性表达，并适用规模化生产。


技术实现要素：

10.本发明的发明人进行了大量探索，以期获得改进的表达免疫球蛋白g降解酶的生产菌株，以及用于生产所述酶的发酵、纯化工艺。
11.发明人对用于表达的ides蛋白酶的编码核苷酸序列进行了密码子优化，并通过大量筛选和多种评价手段(如质粒保有率测试、表达量测试、传代稳定性实验)，确定了用于表达ides蛋白酶的载体和大肠杆菌菌株的优化组合。所述组合能在大肠杆菌细胞间质中高效、稳定地表达ides蛋白酶，显著优于其他组合。
12.发明人还优化了对应的发酵、纯化工艺。采用所述工艺后，上述菌株表达的ides蛋白酶几乎全部为可溶性蛋白形式(不形成包涵体)，且表达量显著提高。另外，本发明的工艺能够实现规模化放大，适用于产业上的大规模生产。
13.相应地，本发明包括以下内容。
14.第一方面，本发明提供编码酿脓链球菌的免疫球蛋白g降解酶(ides蛋白酶)的核苷酸序列，所述ides蛋白酶的氨基酸序列如seq id no：1所示，所述核苷酸序列包含如seq id no：2～12中任一种所示的核苷酸序列，或由其组成。所述核苷酸序列是经过密码子优化的ides蛋白酶编码序列。
15.第二方面，本发明提供一种重组表达载体，其包含第一方面的核苷酸序列。
16.第三方面，本发明提供了一种表达ides的工程菌株，所述工程菌株为包含重组表达载体的大肠杆菌，所述重组表达载体为包含第一方面的核苷酸序列的表达载体，
17.其中所述大肠杆菌为选自下组的大肠杆菌菌株：hms174(de3)、bl21(de3)和bl21 star(de3)；且
18.所述表达载体为pet-9a或pet200/d-topo。
19.在优选的实施方案中，所述菌株和表达载体的组合选自下列组合之一：
20.(1)菌株为hms174(de3)且表达载体为pet-9a(pet-9a-hms174(de3)-ides)；
21.(2)菌株为bl21(de3)且表达载体为pet200/d-topo(pet200/d-bl21(de3)-ides)，和
22.(3)菌株为bl21 star(de3)且表达载体为pet200/d-topo(pet200/d-bl21 star(de3)-ides)。
23.在更优选的实施方案中，所述菌株为bl21(de3)且表达载体为pet200/d-topo(pet200/d-topo-bl21(de3)-ides)。
24.第四方面，本发明提供了一种ides蛋白酶的生产方法，所述方法包括：
25.(a)将第三方面的工程菌株接种到培养瓶中进行种子培养，至od
600
达到1.0～2.1，以获得种子培养物；
26.(b)将步骤(a)获得的种子培养物接种到发酵罐中进行发酵培养；
27.(c)在od
600
达到40～50时加入诱导剂，以诱导ides蛋白酶的表达；
28.(d)收获菌体以获得含有ides蛋白酶的样品。
29.优选地，在步骤(b)中：发酵温度为30℃，进行诱导前将温度降为29℃，加入诱导剂后将诱导温度设为25℃。
30.第五方面，本发明提供了一种ides蛋白酶的生产方法，包括：
31.(a)将经过培养的第四方面的工程菌株通过化学或物理方法破碎，以获得包含ides蛋白酶的裂解液；
32.(b)对步骤(a)中的裂解液进行过滤，以获得包含ides蛋白酶的滤液；
33.(c)对步骤(b)中获得的滤液进行层析处理，以获得纯化的包含ides蛋白酶的溶液。
34.在优选的实施方案中，所述步骤(c)中的层析处理包含不同原理的多个层析处理，例如3个或4个。
35.在具体的实施方案中，所述步骤(c)中层析处理包含不同原理的3个层析步骤，依次为强阴离子层析、陶瓷羟磷灰石(cht)层析、疏水层析。
36.本发明的ides蛋白酶生产菌株和生产工艺至少具有如下优势。
[0037]-本发明构建的表达ides蛋白酶的工程菌株能在大肠杆菌细胞间质中高效稳定表达ides蛋白酶，质粒保有率≥90％且传代表达稳定。
[0038]-本发明的发酵工艺能够实现使目的蛋白ides蛋白酶几乎全部可溶表达，有效地避免在大肠杆菌中以包涵体形式表达。通过本发明的工艺制备的ides蛋白酶纯度高，不含标签，具有较低的杂质水平，并且能够有效控制内毒素水平。
[0039]-本发明的纯化步骤不涉及亲和标签的使用，而是通过多个不同的层析步骤进行纯化。不会涉及标签脱落而有免疫原性的问题，如此获得的ides酶会因不含标签而更加便于应用。
[0040]-本发明的工艺能够通过有效释放胞内物质、从宿主蛋白中分离纯化目标蛋白，有效控制宿主残留物，包括宿主蛋白质和dna。
附图说明
[0041]
图1为不同ides蛋白酶密码子优化编码序列的表达产物的sds-page电泳图。
[0042]
图2为不同ides蛋白酶密码子优化编码序列的表达产物的western blot图。
[0043]
图3为实施例1中由发明人构建的大肠杆菌表达载体bpk2104-ides的质粒示意图。
[0044]
图4a-b为不同发酵控制条件下上清及沉淀中ides蛋白酶的sds-page定量结果。标1、标2、标3、标4分别为上样量为0.28、0.56、1.12、1.68μg的ides酶对照品，建立标准曲线用于定量分析；0h、4h、6h、8h、12h、14h分别为诱导后0h、4h、6h、8h、12h、14h取发酵液，离心后通过化学裂解处理后分离的上清和沉淀样品。(a)实验分组1-1、1-2、1-3、1-4、1-5；(b)实验分组2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-6。
[0045]
图5a-c为pet200/d-topo-bl21(de3)-ides用7l罐发酵表达ides蛋白酶试验的sds-page定量检测结果，(a)诱导后培养不同时间检测可溶表达结果，泳道1为上样5μg的ides酶对照品，泳道2为分子量marker，泳道3～7为诱导后0h、2h、4h、6h、8h菌体超声处理后
离心上清样品，泳道8为其他批次培养16h下罐上清表达对照，(b)诱导后培养12h和16h表达定量结果，泳道1为分子量marker，泳道2～5为上样量为0.5、1.0、2.0、3.0μg的ides酶对照品，泳道6～7为诱导后12h和16h菌体超声处理后离心上清样品，泳道8为其他批次培养16h下罐上清表达对照，(c)诱导后培养不同时间检测包涵体表达结果，泳道1为分子量marker，泳道2～8为诱导后0h、2h、4h、6h、8h、12h和16h菌体超声处理后离心沉淀样品，泳道9为上样5μg的ides酶对照品。
[0046]
图6a-b为pet200/d-topo-bl21(de3)-ides用100l罐放大发酵表达ides蛋白酶试验的sds-page定量检测结果，(a)诱导后培养12h和16h表达定量结果，泳道1为分子量marker，泳道2～5为上样量为0.5、1.0、2.0、3.0μg的ides酶对照品，泳道6～7为诱导后12h和16h菌体超声处理后离心上清样品，泳道8为其他批次培养16h下罐上清表达对照，泳道9为其他批次培养16h下罐沉淀表达对照，(b)诱导后培养不同时间检测包涵体表达结果，泳道1为分子量marker，泳道2为上样5μg的ides酶对照品，泳道3～9为诱导后0h、2h、4h、6h、8h、12h和16h菌体超声处理后离心沉淀样品。
[0047]
图7a-d为ides蛋白制备的sds-page检测结果，(a)阴离子纯化检测结果，泳道1为分子量marker，泳道2为上样5μg的ides酶对照品，泳道3～4为阴离子纯化编号为01和02的洗脱峰样品，(b)cht层析检测结果，泳道1为分子量marker，泳道2为cht层析收集的编号为流穿01的样品，泳道3为第一轮cht层析收集的编号为流穿02的样品，泳道4为第二轮cht层析收集的编号为流穿02的样品，泳道5为cht层析收集的编号为流穿03的样品，泳道6为第一轮cht层析20％洗脱液洗脱的样品，泳道7为第一轮cht层析100％洗脱液洗脱的样品，泳道8为上样5μg的ides酶对照品，(c)phenyl疏水层析检测结果，泳道1为分子量marker，泳道2～3为phenyl纯化编号为01和02的洗脱峰样品，泳道4为上样5μg的ides酶对照品，(d)浓缩换液制备原液检测结果，泳道1为分子量marker，泳道2为上样5μg的ides酶对照品，泳道3为原液，泳道4为切向流浓缩换液后样品。
[0048]
发明详述
[0049]
定义
[0050]
术语“约”或“近似”意指在本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分取决于如何测量或确定该值，即测量系统的局限性。在申请和权利要求中描述特定值的情况下，除非另有说明，否则应当假定术语“约”意味着在特定值的可接受误差范围内。
[0051]
术语“ides蛋白酶”指来自酿脓链球菌的免疫球蛋白g降解酶(immunoglubulin g-degrading enzyme of streptococcus pyogenes)，其能够特异性地将免疫球蛋白g(igg)切割为f(ab’)2片段和fc片段。
[0052]
术语“核苷酸”在本发明的上下文中包括dna和rna。
[0053]“表达构建体”或“表达盒”指包含目的基因和基因表达调控序列的一段核苷酸序列。所述表达调控序列包括但不限于启动子、增强子、终止子、多聚腺苷酸化序列等。
[0054]“载体”或“表达载体”指能够将外源基因携带至细胞内的运载体dna分子。载体的实例包括但不限于质粒、病毒载体、粘粒、人工染色体。用于将外源转基因引入细胞中并促成该转基因表达的载体称为“重组表达载体”。
[0055]“宿主细胞”在本文中指包含外源重组dna如重组表达载体的细胞，也指包含由重
组dna表达所获得的多肽或蛋白的细胞。可将这样的宿主细胞用于进行本发明的ides蛋白酶的生产。
[0056]“工程菌株”在本文中指经过改造的微生物菌株。
[0057]“发酵”或“发酵培养”在本文中指通过在特定条件下培养微生物，从而获得期望的产物的过程。
[0058]“分泌表达”是指目的蛋白被分泌到微生物培养基中的表达形式。
[0059]“胞内表达”是指目的蛋白形成于微生物内部的表达形式。
[0060]“可溶性表达”是指目的蛋白在胞内的正确表达，这是由于有生物学活性的蛋白质通常以可溶性形式存在。
[0061]“包涵体”是微生物胞内表达外源蛋白时，由于在胞内环境下未能形成正确折叠而产生的聚集体，其不具有正确折叠的蛋白质的活性。
[0062]“纯化”在本文中指提高目的蛋白酶在产品中的相对含量的过程。
[0063]“种子培养物”在本文中指从甘油菌起培养发酵，到诱导开始前的大肠杆菌、及所述大肠杆菌所处的培养液。
[0064]
质粒保有率：
[0065][0066]
ides蛋白酶及其编码核苷酸序列
[0067]
为了通过微生物发酵生产ides蛋白酶，需要将编码ides蛋白酶的外源核苷酸序列引入到微生物中。在特定宿主中，由于密码子偏好等原因，编码核苷酸序列会影响目的产物的表达。
[0068]
本发明的核苷酸序列编码的ides蛋白酶的氨基酸序列来自ncbi数据库，登录号为wp_010922160.1，其具有特异性切割igg并产生f(ab’)2和fc片段的能力。
[0069]
在本发明的实施方案中，提供了经过密码子优化的编码ides蛋白酶的核苷酸序列，所述ides蛋白酶的氨基酸序列如seq id no：1所示。本发明的ides蛋白酶的编码序列具有不同于ides蛋白酶的天然编码序列的核苷酸序列。
[0070]
在优选的实施方案中，使用的编码ides蛋白酶的核苷酸序列针对大肠杆菌表达而进行了密码子优化。在具体的实施方案中，所述编码ides蛋白酶的核苷酸序列包含如seq id no：2～12中任一项所示的核苷酸序列。特别优选地，本发明的编码ides蛋白酶的核苷酸序列为seq id no：6(i5)、seq id no：8(i7)或seq id no：11(i10)所示的核苷酸序列。
[0071]
表达载体和工程菌株
[0072]
作为本发明一个重要的方面，本发明提供一种用于表达ides蛋白酶的工程菌株，所述工程菌株为包含重组表达载体的大肠杆菌，所述重组表达载体是包含编码本发明的ides蛋白酶的核苷酸序列的表达载体。
[0073]
本领域人员知晓对于表达特定蛋白而言，使用不同的载体和菌株的组合会表现出显著的差异。
[0074]
首先，不同工程菌株与不同载体启动子之间的适配性不同。
[0075]
其次，不同目标蛋白与不同载体和菌株的适配性不同。一些情况下，外源目标蛋白
对于宿主菌株可能为毒性蛋白，需要选用本底表达低、严谨调控诱导的菌株。换言之，菌株只有在特定的条件下才进行表达，例如在加入化学诱导剂之后。对于不可避免带有稀有密码子的蛋白，也应谨慎选择宿主菌。
[0076]
再次，对倾向于形成包涵体的蛋白而言，是否形成包涵体与蛋白自身结构、表达系统、培养条件都有密切关系，需要尝试不同表达载体与菌株的组合，并优化整个生产系统。
[0077]
综上，对某一个特定的基因而言，适合的表达载体是需要进行筛选的。即使在大肠杆菌这种被广泛使用的生产菌株中，也并不是每一个基因都能成功表达，尤其是当使用的表达系统即工程菌株已被指定时。原核表达的特点为时间短、费用低，需要进行多方案的试验并结合数据分析而选出最适合的表达载体-菌株系统。
[0078]
发明人通过将构建好的重组表达载体转化到不同的生产菌株中，得到含有ides蛋白酶的编码核苷酸序列的阳性克隆。通过对该阳性克隆进行培养并诱导表达，发明人测试了多种不同载体和菌株的组合，并发现了在表达量和非包涵体形式的蛋白比例上表现更优的菌株、载体，特别是表现优异的特定组合。
[0079]
优选地，本发明使用的大肠杆菌选自如下大肠杆菌菌株：hms174(de3)、bl21(de3)和bl21 star(de3)。
[0080]
优选地，本发明使用的表达载体为pet-9a-ides或pet200/d-topo-ides。
[0081]
更优选地，本发明使用的菌株和表达载体的组合选自下列组合之一：
[0082]
(1)菌株为hms174(de3)且表达载体为pet-9a(pet-9a-hms174(de3)-ides)；
[0083]
(2)菌株为bl21(de3)且表达载体为pet200/d(pet200/d-topo-bl21(de3)-ides)，和
[0084]
(3)菌株为bl21 star(de3)且表达载体为pet200/d-topo(pet200/d-topo-bl21 star(de3)-ides)。
[0085]
在更优选的实施方案中，所述菌株为bl21(de3)且表达载体为pet200/d-topo(pet200/d-topo-bl21(de3)-ides)。
[0086]
本发明的特定表达载体和菌株的组合在表达ides蛋白酶不同的编码序列时，均能够以》50mg/l且最高达900mg/l的水平表达ides蛋白酶，特别是通过密码子优化的seq id no：2～12的核苷酸序列进行表达时。
[0087]
需要理解的是，所述重组表达载体除了基础载体和编码序列之外，还可以包含其他元件以支持目的蛋白ides蛋白酶的表达。重要的是，本发明的构建体和表达的目标蛋白中不含用于纯化的标签。
[0088]
将编码序列构建到表达载体中的方法包括：获取目的基因片段，pcr扩增与提纯，获取载体骨架片段，目的基因片段与质粒载体骨架片段连接、转化与筛选。
[0089]
将重组表达载体引入到宿主菌株中的方法包括：电穿孔法、氯化钙化学转化法、原生质体转化法等。
[0090]
发酵工艺
[0091]
在本发明的上下文中，将培养微生物并获得包含目的蛋白，即ides蛋白酶的培养液的过程称为“发酵”。发酵工艺可以包括种子培养阶段和发酵培养阶段。
[0092]“种子培养阶段”是指将保藏在冻干管等的种子取出，接种至新鲜培养基内，活化传代至所需的菌体量或代次。
[0093]“发酵培养阶段”是指通过对微生物(或动植物细胞)进行大规模的生长培养，使之发生化学变化和生理变化，从而产生和积累大量所需要的代谢产物的过程。
[0094]
本发明还提供一种发酵工艺，用于培养包含重组表达载体的工程菌株以使其表达ides蛋白酶。
[0095]
具体而言，所述发酵工艺包括：
[0096]
(a)将本发明的工程菌株接种到培养瓶中进行种子培养，至od
600
达到1.0-2.1之间，以获得种子培养物(种子培养阶段)；
[0097]
(b)将步骤(a)获得的种子培养物以5％(体积比)接种到发酵罐中，进行发酵培养(发酵培养阶段)；
[0098]
(c)在od
600
达到40-50时，加入诱导剂并继续培养，以诱导ides蛋白酶的表达(发酵培养阶段)；
[0099]
(d)收获菌体以获得含有ides蛋白酶的样品。
[0100]
在本发明的方法中，多种条件都会影响生产结果。例如，控制不同阶段的od
600
值、培养基的种类、发酵的温度梯度、诱导的时机，对于实现本发明的最终结果都至关重要。
[0101]
应该理解的是，在生产工艺中的od
600
值反应了培养物中的微生物数量，可以允许在批次间存在一定的变化，因此在本技术中通常以一个范围来定义所需的od
600
值。od
600
的控制和监测可以通过常规手段进行。
[0102]
发明人发现，通过控制如下一种或多种条件，可以显著提高可溶性表达的目的蛋白水平，降低包涵体比例：
[0103]
(1)在种子培养阶段通过控制目的蛋白的本底表达，使其不要过高(例如，结束种子培养阶段时，使od
600
不超过2.1)；
[0104]
(2)在发酵阶段设置发酵-诱导前-诱导的温度梯度；
[0105]
(3)在达到适当的od(例如，实施例中诱导od为45.8)时加入诱导剂；
[0106]
(4)优化有机氮源补料培养基成分；及
[0107]
(5)控制流加速率，以控制菌体生长及蛋白合成速度。
[0108]
优选地，在步骤(a)中，接种比例为0.1～0.5％(体积比)。
[0109]
优选地，在步骤(a)中，作为种子培养基使用lb或tb培养基(terrific broth medium)。
[0110]
优选地，在步骤(a)中，培养的温度优选为约30-37℃。
[0111]
优选地，在步骤(b)和(c)中，使用发酵培养基进行培养。
[0112]
优选地，在步骤(b)中，初始发酵培养温度为约30-33℃。
[0113]
优选地，在步骤(b)和(c)中，将溶氧(do)控制为约20-40％，更优选地控制在约30％。
[0114]
优选地，在步骤(b)和(c)中，将培养物的ph控制在约6.8-7.2，更优选地7.0
±
0.02。
[0115]
在步骤(b)中，当ph和do快速上升时，加入发酵补料培养基。
[0116]
优选地，在步骤(c)中，当od
600
值达到40-60时，优选40-50时进行诱导。
[0117]
优选地，所述诱导剂为iptg。优选地，iptg以0.2-1.0mmol/l的终浓度添加，更优选0.4-0.7mmo/l的终浓度。
[0118]
优选地，在步骤(c)中，在加入诱导剂诱导表达时，将温度降低至约24-25℃。
[0119]
优选地，在步骤(b)和(c)的发酵培养过程中，补料速率控制为约8-15g/h/l。
[0120]
具体地，在步骤(b)和(c)的发酵培养过程中，按照如下补料速率进行补料：
[0121]
第0-2h补料速率8-9g/h/l，
[0122]
第2-4h补料速率9-10g/h/l，
[0123]
第4-7h补料速率11-12g/h/l，
[0124]
第7-11h补料速率12-14g/h/l，
[0125]
第11-13h补料速率14-15g/h/l，
[0126]
第13h以后补料速率12-13g/h/l。
[0127]
优选地，在步骤(c)中，加入诱导剂后再培养约10至24小时，优选12至18小时。
[0128]
优选地，所述发酵基础培养基成分包括：葡萄糖5-15g/kg，优选8-12g/kg；酵母粉5-10g/kg，优选8-10g/kg；大豆蛋白胨5-10g/kg，优选8-10g/kg；磷酸氢二钠5-10g/kg，优选8-10g/kg；磷酸二氢钾1-2g/kg，优选1.5-2g/kg；硫酸铵2-4g/kg，优选2.5-3.5g/kg；氯化钠0.5-1.5g/kg，优选1.0-1.5g/kg；氯化钙0.01-0.1g/kg，优选0.01-0.02g/kg；和硫酸镁1-3g/kg，优选2-3g/kg。优选地，所述发酵基础培养基还包含消泡剂，例如0.5-2g/kg的消泡剂。
[0129]
优选地，所述发酵补料培养基成分包括：葡萄糖300-500g/kg，优选380-420g/kg；酵母粉25-75g/kg，优选50-60g/kg；大豆蛋白胨25-75g/kg，优选50-60g/kg；和硫酸镁1-3g/kg，优选2-3g/kg。
[0130]
通过本发明的发酵方法，可以使ides蛋白酶几乎全部以可溶性形式表达。
[0131]
纯化工艺
[0132]
具体而言，本发明生产ides蛋白酶的方法包括使用本发明的经过密码子优化的ides蛋白酶编码序列，将其构建到特定的表达载体中，再将重组表达载体导入特定的菌株中，在特定的发酵条件下培养所述工程菌株，再以特定的纯化方法进行纯化。
[0133]
本发明还提供对包含ides蛋白酶的菌体进行破菌和纯化以生产ides酶的方法，包括：
[0134]
(a)将经过培养的工程菌株通过化学或物理方法破碎，以获得包含ides蛋白酶的裂解液；
[0135]
(b)对步骤(a)中的裂解液进行过滤，以获得包含ides蛋白酶的滤液；
[0136]
(c)对步骤(b)中获得的滤液进行层析处理，以获得纯化的包含ides蛋白酶的溶液。
[0137]
在步骤(a)中，所述破碎大肠杆菌的化学方法包括但不限于表面活性剂的应用，如tritonx-100，sds，聚山梨酯等，而所述物理方法包括但不限于超声、冻融循环、高压均质等。所述澄清方法包括但不限于囊式滤器澄清、中空纤维柱微滤、膜包超滤等。
[0138]
优选地，所述破碎方法为高压均质，便于逐级放大。
[0139]
在步骤(b)中，可以通过不同的方法对裂解液进行过滤，例如直流过滤，切向流中空纤维柱微滤和超滤。在优选的实施方案中，所述过滤采用直流过滤并使用囊式滤器。作为囊式滤器的膜孔径，优选为1μm、0.6μm、0.45μm、0.22μm；更优选地，膜孔径为0.45μm或0.45μm与0.22μm的组合。
[0140]
在步骤(c)中，需要以特定的顺序进行基于不同原理的层析处理，这也是本发明的纯化工艺中的关键步骤。
[0141]
在优选的实施方案中，所述步骤(c)中层析处理包含不同原理的多个层析处理，例如3个或4个。对于不含亲和标签的蛋白，需要通过利用目标蛋白与宿主杂质之间的理化性质差异进行分离，所述不同原理的层析选自：强阴离子层析、弱阴离子层析、强阳离子层析、弱阳离子层析、疏水层析、分子筛层析、陶瓷羟基磷灰石(ceramic hydroxyapatite type，cht)层析、金属螯合层析、复合层析、肝素亲和层析等。
[0142]
阴阳离子层析基于蛋白表面电荷的差异而分离不同性质的蛋白，通常针对不含亲和标签的蛋白。对于粗提液，首选以阴阳离子层析作为目标蛋白的捕获方法。该方法载量高、可优化条件及空间大，能够通过条件调整捕获目标蛋白并同时大幅去除宿主蛋白和核酸杂质。
[0143]
疏水层析也称为疏水相互作用层析，其借助蛋白的极性分离疏水性差异明显的组分，一般在中纯或精纯中应用。
[0144]
分子筛层析能够根据蛋白分子量分离纯化分子量差异在2倍以上的蛋白，对上样体积要求严格，一般只作为最终精纯或换液步骤，适合用于去除聚合体和分子量差异巨大的小分子量杂质。
[0145]
除此之外，羟基磷灰石(hydroxyapatite)填料既具有钙离子提供的金属螯合特性，同时又具有磷酸根提供的丰富负电荷，对酸碱性蛋白有不同的分离效果，在其他层析介质无法达到预期效果时，可尝试羟基磷灰石填料。
[0146]
在不同的层析步骤之间可以通过切向流(切向流过滤(tangential flow filtration，简称tff))技术进行缓冲液的置换及料液的浓缩，起到衔接层析工艺等作用。
[0147]
优选地，所述3步层析的组合方式可以是阴离子层析、cht层析、疏水层析的组合，或阳离子层析、cht层析、疏水层析的组合。
[0148]
优选地，所述4步层析的组合方式可以是阴离子层析、cht层析、疏水层析、分子筛层析的组合，或阳离子层析、cht层析、疏水层析、分子筛层析的组合。
[0149]
优选地，所述阴离子层析介质可选的配基种类包括但不限于季铵基(quaternary ammonium base，q)，二乙基氨基乙基(diethyl aminoethyl，deae)；所述阳离子层析介质可选的配基种类包括但不限于磺丙基(sulfopropyl，sp)，羧甲基(carboxymethyl，cm)，所述疏水层析介质可选的配基种类包括但不限于苯基(phenyl)、丁基(butyl)、辛基(octyl)等。
[0150]
更优选地，所述3步层析的组合包括：强阴离子层析、cht层析、phenyl疏水层析；所述4步层析的组合包括：强阴离子层析、cht层析、phenyl疏水层析、分子筛层析。优选按照所列顺序进行各个层析步骤。
[0151]
优选地，在所述切向流过滤中，可选择中空纤维柱或膜包进行料液浓缩或换液；所述膜材的孔径优选为20kda、10kda、5kda或3kda，更优地所述膜材的孔径优选为10kda和5kda。
[0152]
经过本发明的纯化工艺之后，能够获得sec-hplc纯度大于98％的高纯度ides蛋白酶，控制工艺相关杂质在极低水平(宿主蛋白＜20ng/mg，宿主dna＜0.01ng/mg)并保证内毒素水平在2eu/ml以下，确保安全性。
[0153]
在具体的实施方案中，综合了上述几个方面的技术方案来生产ides蛋白酶。
2g/kg。
[0177]
16.实施方案15所述的方法，所述发酵培养基的组成为葡萄糖12g/kg，酵母粉10g/kg，大豆蛋白胨10g/kg，磷酸氢二钠5g/kg，磷酸二氢钾1.5g/kg，硫酸铵2.5g/kg，氯化钠1.5g/kg，氯化钙0.01g/kg，硫酸镁lg/kg，消泡剂0.5g/kg。
[0178]
17.实施方案12-16中任一项所述的方法，在步骤(b)和(c)的发酵培养过程中，当ph和do快速上升时，加入发酵补料培养基。
[0179]
18.实施方案12-17中任一项所述的方法，其中将所述补料速率控制在约8-15g/h/l的范围内。
[0180]
19.实施方案18所述的方法，其中在步骤(b)和(c)的所述发酵培养过程中，按照如下补料速率进行补料：
[0181]
第0-2h补料速率8-9g/h/l，
[0182]
第2-4h补料速率9-10g/h/l，
[0183]
第4-7h补料速率11-12g/h/l，
[0184]
第7-11h补料速率12-14g/h/l，
[0185]
第11-13h补料速率14-15g/h/l，
[0186]
第13h以后补料速率12-13g/h/l。
[0187]
20.实施方案17-19中任一项所述的方法，所述发酵补料培养基包含：葡萄糖300-500g/kg，优选380-420g/kg，酵母粉25-75g/kg，优选50-60g/kg；大豆蛋白胨25-75g/kg，优选50-60g/kg；硫酸镁1-3g/kg，优选2-3g/kg。
[0188]
21.实施方案20所述的方法，所述发酵补料培养基的组成为葡萄糖420g/kg，酵母粉50g/kg，大豆蛋白胨50g/kg，硫酸镁2.5g/kg。
[0189]
22.实施方案12-21中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的诱导剂为iptg。
[0190]
23.实施方案22所述的方法，其中所述iptg以0.2-1.0mmol/l的浓度添加，更优选0.4-0.7mmol/l的浓度。
[0191]
24.实施方案12-23中任一项所述的方法，进一步包括如下步骤：
[0192]
(e)将步骤(d)收获的培养物中的菌株通过化学或物理方法破碎，以获得包含ides蛋白酶的裂解液；
[0193]
(f)对步骤(e)中的裂解液进行过滤，以获得包含ides蛋白酶的滤液；
[0194]
(g)对步骤(f)中获得的滤液进行层析处理，以获得纯化的包含ides蛋白酶的溶液。
[0195]
25.实施方案24中所述的方法，其中步骤(g)中的层析处理包含不同原理的多个层析处理，例如3个或4个。
[0196]
26.实施方案25中所述的方法，所述步骤(c)中层析处理包含不同原理的3个层析步骤，依次为强阴离子层析、陶瓷羟磷灰石(cht)层析、疏水层析。
[0197]
27.通过实施方案12-26中任一项的方法获得的包含ides蛋白酶的产物。
实施例
[0198]
下面结合本发明实施例对本发明的技术方案进行具体的描述，本领域技术人员应该知道，这些实施例仅用于说明，并不意在以任何方式对具体的实施方式进行限制。
[0199]
实施例1.密码子优化序列的筛选
[0200]
在本实施例中设计了密码子优化的ides蛋白酶编码核苷酸序列，并构建了不同密码子优化序列的工程菌株，通过测定这些菌株表达目的蛋白时的表现来鉴定并筛选序列。
[0201]
首先，发明人对ides蛋白酶的编码核苷酸序列进行了密码子优化。将氨基酸序列作为原始序列输入密码子优化相关软件，在兼顾gc含量、二级结构、密码子适应指数cai(codon adaptation index)等指标下，筛选出针对大肠杆菌表达系统进行了密码子优化的核苷酸序列。通过所述筛选，发明人获得了适于在大肠杆菌工程菌株中表达ides蛋白酶的一系列ides蛋白酶的编码核苷酸序列，分别命名为i1-i11。
[0202]
i1-i11的核苷酸序列分别示于seq id no：2-12，其均编码如seq id no：1所示的ides蛋白酶的氨基酸序列。通过基因合成技术合成了上述编码核苷酸序列(seq id no：2-12)，并连接入bpk2104表达载体(实验室自制，质粒图如图3所示)，获得含有ides蛋白酶编码序列的bpk2104表达载体，分别命名为bpk2104-i1至bpk2104-i11。
[0203]
使用bpk2104-i1至bpk2104-i11分别转化bl21(de3)工程菌株，挑选阳性克隆进行测序鉴定，将测序鉴定正确的克隆菌株命名为bl21(de3)-bpk2104-i1至bl21(de3)-bpk2104-i11，用于后续进行诱导表达。
[0204][0205][0206]
小量诱导表达
[0207]
使用bl21(de3)-bpk2104-i1至bl21(de3)-bpk2104-i11进行以iptg作为诱导剂进行小量诱导表达，同时以不添加iptg的培养物作为阴性对照，诱导表达后进行超声破菌。通过sds-page和westem blot测定(1)全菌中的目的蛋白含量(将菌体直接进行sds-page电泳的样品处理，即sds裂解及煮沸处理)，(2)超声破菌之后上清中的目的蛋白含量，和(3)超声破菌之后沉淀中的目的蛋白含量，由此来评价含有不同的密码子优化序列的菌株的表现。
[0208]
具体而言，按0.1％接种量将上述11个菌株分别转接至无抗性lb液体培养基中，并于37℃、200～220rpm振荡培养。当培养至od
600
为0.6-1.0时，加入终浓度为0.5mmol/l的iptg(阴性对照组不添加)进行诱导，并继续于28
±
0.5℃ 200rpm振荡培养约18～19h。之后终止表达，并离心收菌。
[0209]
对各组的菌体进行超声破菌后，8000-12000g离心10min分离上清和沉淀，对每种菌株培养物的沉淀和上清分别进行12％sds-page电泳和western blot鉴定(一抗：sty9-mm13，sino biological；二抗：800cw goat anti-mouse，)，检测结果见图1与图2。
[0210]
图1和图2中显示了诱导条件下全菌样品、超声上清样品、超声沉淀样品中的结果。图1中i1的sds-page结果(上方第一块凝胶照片)显示，包含i1序列的菌株培养物的超声上
清和超声沉淀样品均显示出与ides标品对应的条带，该结果说明目的蛋白有表达，但超声上清样品中的条带强度显著更强。在图2的i1相关样品的western blot的结果(图2最上图)中，超声后的沉淀样品目的条带同样较弱。该结果说明，通过bl21(de3)-bpk2104-i1表达的目的蛋白大部分位于超声破菌后的上清中，即表达位置为细胞间质，因为包涵体表达会使目的蛋白的表达产物主要集中在沉淀中。
[0211]
除了上述i1组外，图1和图2还显示了i2-i11组的sds-page和western blot结果，包括i2-i11组的超声上清样品的sds-page和western blot结果，i2-i8组超声沉淀样品的sds-page，以及i7和i9组的超声沉淀和全菌的western blot结果。结果显示，蛋白主要以可溶形式表达，大部分处于超声后的上清中。
[0212]
如上所述，密码子优化序列i(1～11)组中的非还原样品在超声后，经sds-page和western blot确认，在上清中均有ides蛋白酶表达。
[0213]
结果证实，密码子优化序列i(1～11)的表达载体均能在大肠杆菌中有效表达ides蛋白酶目的蛋白。sds-page检测样品取样、处理、点样量完全保持一致，结果显示：通过相对定量，在相同上样量的条件下，密码子优化序列i5、i7、i10组的样品表达量相对较高。
[0214]
实施例2.构建表达ides蛋白酶的大肠杆菌工程菌株
[0215]
在本实施例中构建了多种表达ides蛋白酶的工程菌株。
[0216]
使用实施例1中所述的i7的编码核苷酸序列(seq id no：8)，将其连接到4种表达载体pet-9a、pet-26b、bpk2104和pet200/d-topo中(所述表达载体分别来自merck、淼灵质粒平台、实验室自制、thermo fisher scientific，其中bpk2104的质粒图谱如图3所示)，由此获得了对应的4种重组表达载体pet-9a-ides、pet-26b-ides、bpk2104-ides和pet200/d-topo-ides。接着，通过采用与各个载体对应的抗生素抗性筛选以及测序鉴定了构建的重组表达载体。
[0217]
使用经鉴定正确含有目的序列核苷酸的上述各表达载体转化如下7种大肠杆菌菌株：hms174(de3)、bl21(de3)、bl21(de3)plyss、transetta(de3)、rosetta-gami2(de3)、arcticexpress(de3)和bl21star(de3)(依次分别购自merck、thermo fisher scientific、invitrogen、北京全式金生物技术股份有限公司、上海唯地生物技术有限公司(唯地)、唯地、thermofisher scientific)。得到了含有上述重组表达载体的多种工程菌株。“de3”表示该大肠杆菌菌株携带溶源性噬菌体λde3，并因而含有t7 rna聚合酶基因，能够更好地配合含有t7启动子的表达载体的表达。将获得的全部菌株以甘油储液(glycerolstock)形式保存。
[0218]
实施例3.不同大肠杆菌工程菌株的诱导表达
[0219]
在本实施例中，使用实施例2中获得的甘油储液的菌种进行了诱导培养，以表达ides蛋白酶，并检测了不同载体与菌株组合的表达结果，包括表达水平、表达形式。
[0220]
将实施例2制备的甘油储液的菌种(甘油菌)形式的各工程菌株按4％比例(体积比)分别接种于20ml tb(terrific broth medium)液体培养基中，于37℃、250rpm下振荡培养约3h。待菌浓od
600
达到约2.0-3.0时，用新鲜的tb培养基分别将各菌株的菌液调整至od
600
＝1.0，并分别取调整后的菌液20ml置入新的100ml无菌锥形瓶中。
[0221]
向培养液中加入iptg(终浓度0.1mmol/l)以诱导表达，并置于25℃、250rpm下继续振荡培养过夜(约15h)，以完成诱导表达。
[0222]
诱导表达结束后，分别取样测定了培养物的od
600
值，并分别收集培养物5ml，于12000rpm下离心10min收集了上清及菌体(沉淀形式)。
[0223]
对离心获得的菌体进行超声破菌，而后进行12％的sds-page电泳，同实施例1类似地检测评估了ides蛋白酶在菌体中不同位置(胞质或包涵体)的表达量。将结果总结于表1。
[0224]
表1.不同表达载体与不同宿主菌株交叉适配的结果
[0225][0226][0227]
结果显示，在使用pet-9a-ides载体转化的6种不同工程菌株中，表达量差异较大，并且ides重组蛋白既在胞质表达又在包涵体中表达。由于目的蛋白的定位不能确定，表达条件难以控制。
[0228]
对于同一宿主菌bl21(de3)，与不同表达载体组合时表达量差异较大，表达目的蛋白的位置差异也较大。
[0229]
bpk2104-ides虽然表达量也较高，但该表达载体是cam抗性，从体内安全性考虑，仅用其进行了密码子筛选，而未继续进行质粒保有率等研究。
[0230]
综上，在使用pet200/d-topo-ides载体转化的2种工程菌株中，表达量均高于0.5g/l，且ides蛋白倾向于在胞质表达。其余表达载体与菌株的组合表达量均较低。
[0231]
实施例4.质粒保有率和传代稳定性测试
[0232]
发明人根据诱导表达产量或表达定位的评估结果，排除了产量过低的载体与菌株的组合。
[0233]
在本实施例中，对优势菌株pet-9a-hms174(de3)-ides、pet-9a-bl21(de3)-ides、pet-9a-bl21(de3)plyss-ides、pet9a-arcticexpress(de3)-ides、pet200/d-topo-bl21(de3)-ides、pet200/d-topo-bl21 star(de3)-ides进行了质粒保有率和传代稳定性实验。
[0234]
具体而言，将各个菌株(甘油菌)以2％比例(体积比)接种于10ml lb液体培养基中，在37℃、250rpm下恒温振荡培养。培养至od
600
为1～2时，按2％体积比进行接种传代。
[0235]
对不同代次p1～p6或p1～p10(p6代表第6次转接，p10代表第10次转接)进行了质粒保有率测试，并按照与实施例3中相似的诱导表达方法测试了表达水平，评价了传代稳定性。
[0236]
质粒保有率
[0237]
1.用培养基将菌液稀释至稀释倍数为10-6
、10-7
、10-8
，分别将菌液涂布到lb固体培养基上，37℃培养17小时。
[0238]
2.选择菌落数在30-300个范围的培养皿，从皿中挑选100个生长良好的菌落，分别接种到含抗生素(硫酸卡那霉素)的lb固体培养基和不含抗生素的lb培养基上，在37℃下培养12小时。
[0239]
3.统计各培养基上的菌落数。
[0240]
4.按照如下公式计算质粒保有率：
[0241][0242]
将质粒保有率的结果汇总示于表1。表1中，当某菌株的质粒保有率低于90％视为质粒保有率不合格。
[0243]
结果显示，使用pet-9a-ides载体转化的6种工程菌株中，仅菌株pet-9a-hms174(de3)-ides的质粒保有率合格且传代表达稳定，其余表达载体与菌株的组合出现产量下降等问题，质粒保有率和传代稳定性均不合格。
[0244]
使用pet200/d-ides载体转化的2种工程菌株中，菌株pet200/d-topo-bl21(de3)-ides和pet200/d-topo-bl21 star(de3)-ides的质粒保有率合格且传代表达稳定，其余表达载体与菌株的组合质粒保有率和传代稳定性均不合格。
[0245]
从表1的结果可见，表达水平、表达形式、工程菌株稳定性等特征随着具体的菌株和载体组合而变化。没有观察到同一种载体在转入任意菌株时都能提供优秀的表达性能，也没有观察到同一种菌株在承载任意载体时能够提供优秀的表达性能。
[0246]
不意在限定原理，发明人推测，这可能是由于目的蛋白ides蛋白酶的分子结构、分子量大小、折叠方式或立体构象等特性，使得使用不同表达载体转化相同工程菌株时，目的蛋白的表达与传代稳定表现具有不同；相同表达载体转化不同工程菌株时，目的蛋白的表达与传代稳定性表现也不相同。例如，当使用不同的质粒pet-9a-ides、pet-26b-ides、bpk2104-ides和pet200/d-topo-ides转化相同的菌株bl21(de3)时，表现参差不齐。又如，使用相同的质粒pet-9a-ides转化不同的菌株hms174(de3)、bl21(de3)、bl21(de3)plyss、transetta(de3)、rosetta-gami2(de3)、arcticexpress(de3)时，结果也各不相同。可知对于特定的目的外源蛋白，载体与菌株的组合的关键属性需要实际地筛选，何种组合最优并非是显而易见的。
[0247]
发明人通过大量工作，针对经过密码子优化的ides编码核苷酸序列，筛选出了最优的载体和工程菌株的组合，即pet-9a-hms174(de3)-ides、pet200/d-topo-bl21(de3)-ides或pet200/d-bl21-star(de3)-ides，并探索了适合的发酵和制备、纯化条件。
[0248]
实施例5.使用工程菌株pet-9a-hms174(de3)-ides进行发酵条件(5l罐)的优化
[0249]
本实施例采用实施例3和4中筛选出的菌株pet-9a-hms174(de3)-ides探索了发酵条件的优化策略。测试的不同发酵条件包括种子od、诱导时长、发酵培养基和补料培养基的组成等。
[0250]
试验材料
[0251]
发酵罐：百仑2联5l玻璃发酵罐
[0252]
菌株：pet-9a-hms174(de3)-ides
[0253]
种子培养基：lb培养基，配方成分为每升含有大豆蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g，ph7.0。
[0254]
甘油工艺发酵培养基甘油8g/kg酵母粉10g/kg大豆蛋白胨10g/kg磷酸氢二钠5g/kg，磷酸二氢钾1.5g/kg，硫酸铵2.5g/kg，氯化钠1.5g/kg，氯化钙0.01g/kg，硫酸镁1g/kg，消泡剂0.5g/kg。
[0255]
甘油补料培养基：甘油450g/kg，酵母粉50g/kg，大豆蛋白胨50g/kg，硫酸镁2.5g/kg。
[0256]
葡萄糖工艺发酵培养基：葡萄糖12g/kg，酵母粉10g/kg，大豆蛋白胨10g/kg，磷酸氢二钠5g/kg，磷酸二氢钾1.5g/kg，硫酸铵2.5g/kg，氯化钠1.5g/kg，氯化钙0.01g/kg，硫酸镁1g/kg，消泡剂0.5g/kg。
[0257]
葡萄糖补料培养基：葡萄糖420g/kg，酵母粉50g/kg，大豆蛋白胨50g/kg，硫酸镁2.5g/kg。
[0258]
具体的培养过程如下所示。
[0259]
种子培养阶段(摇瓶)
[0260]
按lb配方配制种子培养基，分装125ml/500ml摇瓶，高压蒸汽灭菌121℃，20分钟。
[0261]
从菌株库中取出pet-9a-hms174(de3)-ides甘油储液，在超净工作台中复苏后，以0.1％(体积比)接种至摇瓶，在30℃培养至1＜od
600
值＜4，作为培养好的种子培养物。
[0262]
发酵培养阶段
[0263]
将发酵培养基和补料培养基按配方加纯化水充分溶解后，装入发酵罐和补料瓶中进行灭菌。发酵罐灭菌后，连接冷却水管路及探头(温度、ph、do)，开启温控，待各参数稳定后校准溶氧电极100％。
[0264]
将上述培养好的pet-9a-hms174(de3)-ides种子培养物接入发酵罐中，开始发酵培养。
[0265]
具体而言，发酵培养使用了下列基础条件。
[0266][0267]
在发酵过程中，将溶氧通过搅拌关联的方式维持在20-40％左右。ph控制在7.0
±
0.02，用氨水和磷酸调节，并设置为自动模式。发酵温度30℃，进行诱导前将温度降低至29℃，诱导后温度调整为25℃。当初始底物消耗完，ph和do快速上升时开启补料。当菌液od
600
值达到40-50时，加入终浓度0.4mmol/l iptg进行诱导表达，同时将温度调整为25℃。
[0268]
在发酵过程中，每间隔一定时间(诱导0、6、9、12、14小时后)进行一次取样(发酵液)，检测样品的od
600
，并通过sds-page检测ides目标蛋白酶在破菌后分别获得的上清和沉淀中的表达量。诱导一定时间后，当菌体生长进入平台期，od
600
值不再上升或有下降趋势时，结束发酵并同实施例3离心收集菌体。将sds-page定量检测的蛋白表达结果示于图4和表2。
2、2-4组)，则无论控制条件如何调整，包涵体表达占比均较高。同时可见，在种子od
600
控制为较低时(1-1、1-4、2-1、2-3、2-5、2-6组)，目的蛋白能够实现较高比例的胞质表达。
[0272]
这些结果提示，为了使目的蛋白以较高比例在胞质表达，应当尽量对种子od
600
进行控制，当种子od
600
在2.1之下时结束种子培养阶段。
[0273]
关于培养基成分，结果显示营养物的增加没有对菌体生长速率造成明显影响。
[0274]
关于诱导od
600
，发现当诱导od
600
过高时，对目的蛋白的胞质定位表达不利(1-2、1-3)。关于诱导时间，发现即使对诱导时间进行延长，放罐od
600
也没有继续地增加，提示对于表达量而言，诱导时间并非最关键的控制条件。
[0275]
表2中显示，虽然1-5组与1-4组的培养条件非常接近，在实际操作中，1-5组补料速率比其他批次稍快，但结果相差较多。具体而言，1-5组中与菌体浓度相关的放罐od
600
(60.58)比1-4组(52.24)高约7个od
600
左右，但目的蛋白总产量及胞质表达占比均低于1-4组。该结果提示为了促进目的蛋白的胞质表达可以适当降低流加补料速率，从而控制菌体生长速率、不使菌体生长速率变得过快。
[0276]
2-3和2-5组的目的蛋白表达水平最高。表2中显示，当种子od分别为1.77和1.91(在各组中偏低)时，且诱导od为45.8和44.5时，采用特定的有机氮源补料培养基成分及控制流加速率(补料速度)能够获得更高的放罐od与ides蛋白酶的表达水平，表达的ides蛋白酶的胞质表达占比更高。
[0277]
综上所述，通过不是在发酵培养阶段，而是提前在种子培养阶段控制目的蛋白的表达(例如，种子培养od
600
不高于2.1)，结合在发酵过程中特异的梯度温度控制以及有机氮源的流加补料(培养基配方和补料速度)以控制发酵阶段的蛋白合成速率不要过高，并在合适的od
600
开始诱导，能够实现使目的蛋白几乎全部为可溶性表达，且蛋白表达量接近1g/l的效果。
[0278]
实施例6.采用pet200/d-topo-bl21(de3)-ides工程菌株的发酵(3l发酵规模)
[0279]
本实施例采用了工程菌株pet200/d-topo-bl21(de3)-ides，以检测实施例5的优选发酵条件是否适用于其他ides工程菌株。
[0280]
试验材料
[0281]
发酵罐：bioengineering 4联7l发酵罐
[0282]
菌株：pet200/d-topo-bl21(de3)-ides
[0283]
种子培养基：lb培养基，配方成分为每升含有大豆蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g，ph7.0。
[0284]
发酵培养基：葡萄糖12g/kg，酵母粉10g/kg，大豆蛋白胨10g/kg，磷酸氢二钠5g/kg，磷酸二氢钾1.5g/kg，硫酸铵2.5g/kg，氯化钠1.5g/kg，氯化钙0.01g/kg，硫酸镁1g/kg，消泡剂0.5g/kg。
[0285]
补料培养基：葡萄糖420g/kg，酵母粉50g/kg，大豆蛋白胨50g/kg，硫酸镁2.5g/kg。
[0286]
具体的培养过程如下所示。
[0287]
种子培养阶段(摇瓶)
[0288]
按lb配方配制种子培养基，分装125ml/500ml摇瓶，高压蒸汽灭菌121℃，20分钟。
[0289]
从菌株库中取出pet200/d-topo-bl21(de3)-ides甘油储液，在超净工作台中复苏后，以0.1％(体积比)接种至摇瓶，在37℃培养至od
600
值接近2，作为培养好的种子培养物。
[0290]
发酵培养阶段
[0291]
发酵培养阶段使用了下列条件，其他步骤和参数与实施例5相同。
[0292][0293][0294]
在发酵过程中，每2h进行一次取样，检测了样品的od
600
，并通过sds-page检测了目的蛋白ides蛋白酶在破菌获得的上清及获得的沉淀中的表达量。诱导16h后，结束发酵并收集菌体。将sds-page定量检测的蛋白表达结果示于图5。
[0295]
从图5可见，目的蛋白几乎全部为可溶性表达，蛋白表达量大于6g/l。结果证实上述不同菌种通过本发明的发酵控制策略，均能实现目的蛋白的可溶性表达(胞质表达)，且表达产量比现有技术大大提高。
[0296]
实施例7.采用pet200/d-topo-bl21(de3)-ides工程菌株的规模放大发酵(100l规模发酵)
[0297]
本实施例中，对发酵工艺进行了规模放大，放大至100l，以测试筛选出的工程菌株的性能。
[0298]
试验材料
[0299]
发酵罐：东富龙100l发酵系统
[0300]
菌株：pet200/d-topo-bl21(de3)-ides
[0301]
一级种子培养基：配方成分为每升含有大豆蛋白胨16g、酵母粉10g、氯化钠5g，ph7.0
[0302]
二级种子培养基：配方成分为每升含有大豆蛋白胨16g、酵母粉10g、氯化钠5g，ph7.0
[0303]
发酵培养基：葡萄糖12g/kg，酵母粉10g/kg，大豆蛋白胨10g/kg，磷酸氢二钠5g/kg，磷酸二氢钾1.5g/kg，硫酸铵2.5g/kg，氯化钠1.5g/kg，氯化钙0.01g/kg，硫酸镁1g/kg，消泡剂0.5g/kg。
[0304]
补料培养基：葡萄糖420g/kg，酵母粉50g/kg，大豆蛋白胨50g/kg，硫酸镁2.5g/kg。
[0305]
具体的培养过程如下所示。
[0306]
一级种子培养(摇瓶)
[0307]
按种子液配方配制种子培养基，分装125ml/500ml摇瓶，高压蒸汽灭菌121℃、30mins。从菌株库中取出甘油菌，在生物安全柜中复苏后，以0.1％(体积比)接种至摇瓶，37℃振荡培养至od
600
值为2.0。
[0308]
二级种子培养(摇瓶)
[0309]
将已灭菌的二级种子培养基，分装至1000ml摇瓶，以0.1％(体积比)接种量将一级种子接种至摇瓶，37℃振荡培养至od
600
值为2.0。
[0310]
发酵培养阶段
[0311]
发酵培养阶段使用了下列条件，其他步骤和参数与实施例4相同。
[0312][0313]
在发酵过程中，每2h进行一次取样，检测了样品的od
600
，并通过sds-page检测了ides目标蛋白酶在破菌后获得的上清和沉淀中的表达量。
[0314]
诱导16h后，结束发酵并收集菌体。同实施例3地进行超声破菌。
[0315]
将sds-page定量检测的蛋白表达结果示于图6。
[0316]
从图6可见，放大到100l罐规模下时，使用pet200/d-topo-bl21(de3)-ides工程菌株通过上述发酵工艺获得的目的蛋白几乎全部为可溶性表达，蛋白表达量大于5.8g/l。表达产量与7l罐规模的结果一致。说明优化的发酵条件也适用于不同的优化组合筛选菌株。证明本发明的ides蛋白发酵控制策略与发酵条件能够等比放大到100l发酵规模，因此非常适用于工业生产。
[0317]
实施例8.ides蛋白酶的制备与纯化
[0318]
本实施例描述了从发酵产物中制备ides蛋白酶的工艺。
[0319]
试验材料
[0320]
上游发酵菌体：pet200/d-topo-bl21(de3)-ides工程菌株经发酵后收集的菌体
[0321]
重悬液：20mmol tris，ph 8.00
±
0.10
[0322]
原液保存缓冲液：20mmol/l pb，1.5mmol/l依地酸二钠，0.1g/l聚山梨酯80(吐温80)，30g/l甘露醇，ph7.2
±
0.10
[0323]
q柱：diamond q(博格隆(上海)生物技术有限公司)
[0324]
cht层析柱：ceramic hydroxyapatite，type ii(40μm)(bio-rad)
[0325]
phenyl层析柱：phenyl 30l(苏州纳微科技股份有限公司)
[0326]
菌体破碎与料液澄清
[0327]
将上游发酵菌体用1∶15-20(g∶ml)比例的重悬液重悬，采用高压均质的方法破碎菌体，释放胞质蛋白。采用0.45μm孔径滤膜通过蠕动泵获得澄清料液。
[0328]
层析制备ides蛋白酶
[0329]
q柱：采用q柱捕获ides蛋白酶。柱子使用至少5个柱体积的平衡缓冲液1平衡，澄清料液在ph7.5上样至q柱，载量＜30mg/ml介质，在25个柱体积下进行梯度洗脱，洗脱缓冲液从0％升高至30％，线性洗脱了目标蛋白。
[0330]
平衡缓冲液1：20mmol/l tris，ph7.5。
[0331]
洗脱缓冲液1：在平衡缓冲液1中添加1mol/l氯化钠。
[0332]
cht层析柱：将洗脱峰上样至预平衡的cht层析柱(平衡缓冲液：20mm pb，ph7.5)，收集流穿液。向cht流穿液中补加饱和硫酸铵，至硫酸铵终浓度为20％，2-8℃静置60min，获得料液。
[0333]
phenyl层析柱：采用phenyl层析柱精细纯化ides蛋白酶。
[0334]
phenyl层析柱以20mmol/l pb，2mol/l(nh4)2so4，ph7.5平衡。将cht层析柱获得的料液上样至phenyl层析柱，载量＜5mg/ml，以50％疏水洗脱液(20mmol/l pb，ph7.5)进行洗杂，以50-100％疏水洗脱液线性洗脱目标蛋白。
[0335]
最终通过切向流技术将ides蛋白酶换液至原液保存缓冲液(配方如上所述)中。
[0336]
通过sds-page检测纯化后的样品，结果见图7。
[0337]
经过3步层析，ides蛋白酶page纯度＞95％。另外，还检测了活性(elisa法)、含量(紫外-可见分光光度法)、sec-hplc纯度、宿主杂质(hcp-elisa，hcdna-qpcr)、内毒素含量(凝胶限度法)、汇总收率等数据，结果总结在下表3中。
[0338]
表3.ides蛋白制备过程检测结果汇总
[0339][0340]
na表示本步骤样品不适合本检测方法，不做检测。
[0341]
从表3的结果可知，经过3步层析，产品中的内毒素水平得到了有效控制，低至0.5eu/ml水平，宿主细胞蛋白(hcp)及宿主细胞dna(hcdna)残留控制均远远达到药物体内
注射要求标准。上述纯化过程后很好地保留了ides蛋白酶活性，获得的产品纯度高达95％以上。
[0342]
本发明的ides蛋白酶制备纯化工艺包括高压均质破菌，层析及切向流工艺，均能够线性放大，进行大规模生产。
[0343]
序列信息
[0344]
seq id no：1，ides蛋白酶的氨基酸序列
[0345][0346]
seq id no：2，ides蛋白酶的密码子优化编码序列i1
[0347][0348]
seq id no：3，ides蛋白酶的密码子优化编码序列i2
[0349][0350][0351]
seq id no：4，ides蛋白酶的密码子优化编码序列i3
[0352][0353]
seq id no：5，ides蛋白酶的密码子优化编码序列i4
[0354][0355]
seq id no：6，ides蛋白酶的密码子优化编码序列i5
[0356]
[0357][0358]
seq id no：7，ides蛋白酶的密码子优化编码序列i6
[0359][0360]
seq id no：8，ides蛋白酶的密码子优化编码序列i7
[0361][0362][0363]
seq id no：9，ides蛋白酶的密码子优化编码序列i8
[0364][0365]
seq id no：10，ides蛋白酶的密码子优化编码序列i9
[0366][0367]
seq id no：11，ides蛋白酶的密码子优化编码序列i10
[0368]
[0369][0370]
seq id no：12，ides蛋白酶的密码子优化编码序列i11
[0371]