专利名称：组蛋白瓜氨酸肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及衍生自组蛋白H4蛋白的瓜氨酸合成肽，和其在诊断自体免疫疾病特别是类风湿性关节炎(RA)中的应用。当前技术水平类风湿性关节炎(RA)是以T和B细胞介导的自体免疫机制为特征的炎性关节病。在RA患者的生物液体中能检测到不同的自体抗体。一些这种自体抗体能用于RA诊断和跟
I 示。最著名的RA生物标记是类风湿因子(RF)，这是针对免疫球蛋白IgG同种型Fe区的IgG或IgM类抗体。然而，由于其也能在其他病理条件和老年健康个体中发现，RF不是特异性的RA标记。使用抗核周因子和抗角蛋白抗体发现RA中涉及瓜氨酸(cit)表位推·进了新型高特异性RA生物标记的鉴定。不同的瓜氨酸肽和蛋白用于设定特异和灵敏的诊断试验，能识别RA自体抗体，因此通常称为抗瓜氨酸肽(CP)抗体(ACPA) [US20020143143，US20070087380, EP1946109, US20070148704, W02009007846, W02009000077, W02007017556,EP1456662, W01999028344, W02008132264] 与RA相关的所有蛋白中，下列瓜氨酸序列用于诊断试验:纤维蛋白[C. Masson-BessiSre 等，J. Tmmuno 1. 2001, 166，4177],胶原 II [H.Burkhardt 等，Eur. J. Tmmuno1. 2005, 35, 1643]，波形蛋白[E. R. Vossenaar 等，ArthritisRheum. 2004，50，3485]，丝聚蛋白[US20090028885, US7445903, US6890720]，和病毒蛋白[C. Anzilotti 等，J. Rheumatol. 2006，33，647 ;W02004087747]。测试的灵敏度通过使用丝聚蛋白衍生的合成环瓜氨酸肽(CCP)来增加，[G. A. Schellekens 等，J. Clin. Invest. 1998，101，273] [W01998022503]，所述环瓜氨酸肽特征为使瓜氨酸最佳暴露以用于抗体结合的结构。目前，发展出三代CCP测试CCP1(灵敏度68%,特异性 98%) [G. A. Schellekens 等，Arthritis Rheum. 2000，43，155]，CCP2 (灵敏度范围 39-94%,特异性范围 81-100%) [J. Avouac 等，Ann. Rheum. Dis. 2006，65，845]，和 CCP3 (灵敏度范围 51-83%,特异性范围 93-98%) [L. Lutteri 等，Clin. Chim. Acta2007, 386，76]。这些RA诊断ELISA都市售可得(荷兰阿纳姆的ED公司(Euro-Diagnostica);苏格兰敦提的轴盾公司(Axis-Shield);美国圣地亚哥的INOVA公司)。近来，使用爱泼斯坦-巴尔病毒的EBNA-1 (VCPI)和EBNA-2 (VCP2)衍生的瓜氨酸序列能设定特征为特异性和灵敏度与CCP2和CCP3测试报道的那些相似的诊断试验[F. Pratesi 等，Arthritis Rheum. 2006, 54, 733; C. Anzilotti 等，J. Rheumatol. 2006, 33, 647;TO2004087747;EP091767764]。有趣的是，基于 CCP2、CCP3、VCP1 和 VCP2 的测试性能比较表明不同的瓜氨酸序列能检测相同患者组中抗CP抗体的不同亚组。这些结果证明与XG或XnonG单位(X=瓜氨酸)的假设独有作用相比，瓜氨酸残基周围的氨基酸序列在形成抗CP表位中起重要作用[EP1693673]。通过组蛋白表示与其他自体免疫疾病相关但尚未直接涉及RA诊断的另一类蛋白。组蛋白是核小体的成分，并且分成六类H1、H2A、H2B、H3、H4和H5。从Hl和H2B衍生的序列用于检测系统性红斑狼疮、RA和系统性硬化病中的自体抗体[W003044054]。即使已知这些蛋白是天然脱亚胺并且通常被修饰[K. Arita等，PNAS2006, 103, 5291 ;A. J. ff. Zendman等，Anal. Biochem. 2007, 369，232]，至今没有组蛋白瓜氨酸序列与RA相关。然而，描述用于抗体检测的基于使用经修饰组蛋白(如磷酸化、甲基化、乙酰化和泛素化)但不是瓜氨酸化的微阵列[W007132177]。 Osborne 等[Biochemistry, 2007，46(46)，13370-13381]描述了在位点 17 和 19 有瓜氨酸残基的组蛋白H4片段(1-21)的化学合成以用于酶学研究。Wysocka 等[Frontiers in Bioscience, 2006, 11, 344-355]公开了体内仅在位点3被瓜氨酸化的组蛋白H4和由体外脱氨可得的在位点3、17和19有瓜氨酸残基的组蛋白H4。Hagiwara 等[Biochemistry, 2005, 44 (15), 5827-5834]公开了在位点 3 有 Cit 的组蛋白H4片段(1-23)和(1-5)。W02009/147201公开了结合剂，例如与包含酶促瓜氨酸组蛋白H4在内的瓜氨酸肽特异性结合的抗体。这些结合剂用于预防或治疗自体免疫疾病，特别是RA。W02010/117694公开了包含位点23和95处瓜氨酸残基的组蛋白H4片段组合的序列。W02004/078098公开了与组蛋白不相关并且主要由瓜氨酸残基组成的肽。
发明内容
本发明涉及衍生自核心组蛋白H4的瓜氨酸合成肽，及其在诊断自体免疫疾病特别是RA中的应用。RA中组蛋白脱亚氨基作用的研究产生衍生自H4的一系列瓜氨酸序列的定义。这些序列能识别对RA特异的自体抗体。根据本发明的瓜氨酸肽衍生自人H4的氨基酸序列，特别是衍生自包含所述序列氨基酸(aa)l_aa50的序列(Swiss-PiOtP62805aa2-aa51)。因此本发明的目标是通过以下定性肽-抗原有效性和能特异结合自体免疫疾病特异性抗体，和-从氨基到羧基末端包含氨基酸序列S G X1G K G G K G L G K G G A K X2H X3K V L X4D N I Q G I T K PA I X5X6LA X7X8G G V K X9I S G L I (SEQ ID No. I,式I，也称为H4 (1-50))或其至少7个氨基酸长的功能片段，其中所述氨基酸X1-X9独立选自精氨酸残基或瓜氨酸残基，并且X1-X9中至少两个是瓜氨酸残基。本发明所述的和具有至少两个瓜氨酸残基的肽，显示对RA的特异诊断非常合适。对包含至少7个aa残基和衍生自H4 (1-50)(式I)的更短肽序列特别感兴趣。优选所述肽是SEQ ID No. I的功能片段，并且包含所述氨基酸序列S G X1G K G GKGLGKGGAKX2H X3K (SEQ ID No. I 的 aal_aa20)或G A KX2H X3K V L X4D N I Q GITKPA I (SEQ ID No. I 的 aal4_aa34，也称为 H4 (14-34))或 K P A I X5X6L A X7X8G GV K X9I S G L I (SEQ ID No. I 的 aa31_aa50，也称为 H4 (31-50))或其至少 7 个氨基酸长的功能片段，其中所述氨基酸X1-X9独立选自精氨酸残基或瓜氨酸残基，并且X1-X7中至少两个是瓜氨酸残基。优选，所述肽包含序列S G Cit G K G G K G L G K G G A K Cit H Cit K VL CitD N I Q G I T K P A I Cit Cit L A Cit Cit G G V K Cit I S G L I(SEQ ID No. 1，其中所有X1-X9是瓜氨酸(CU)残基，式II)或是其至少7个氨基酸长的功能片段。优选，所述肽包含选自下组的序列SGCitGKGGKGLGKGGA KCit HCit K(SEQ ID No. I 的 aal-aa20，其中 X1-X3 是瓜氨酸(Cit)残基，式 III)，G A K Cit HCit K V L Cit D N I Q G I T K P A I (SEQ ID No. I 的 aal4_aa34，其中 X2-X4 是瓜氨酸(Cit)残基，式 IV)，K P A I Cit Cit L A Cit Cit G G V K Cit IS G L I (SEQ ID No. I的aa31_aa50，其中&_\是瓜氨酸(CU)残基，式V)或是其至少7个氨基酸长的功能片段。优选，上述肽是线形形式或多亚基分支肽形式或其他偶联复合体形式。多亚基分支肽优选由以下组成-MAP 核结构； -有式III、IV和/或V的氨基酸序列的线形肽，通过化学键结连接每一个MAP核结构的氨基末端残基，其中线形肽彼此相同或不同。根据本发明，MAP核结构是
权利要求
1.一种肽，所述肽的特征为 -抗原有效性和能特异结合自体免疫疾病特异性抗体，和 -从氨基到羧基末端包含氨基酸序列S G X1G K G G K G L G K G G A K X2H X3K V L X4D N I Q G I T K PA I X5X6L AX7X8G G V K X9I S G L I (SEQ ID No. I)或其至少7个氨基酸长的功能片段，其中所述氨基酸X1-X9独立选自精氨酸残基或瓜氨酸残基，并且X1-X9中至少两个是瓜氨酸残基。
2.如权利要求I所述的肽，其特征在于，所述SEQID No. I的功能片段包含所述氨基酸序列 Sgx1Gkggkglgkggakx2H x3k (seq idno. I 的 aai-aa20)或g a k x2hX3K V L X4D N I Q G I T K P A I (SEQ IDNo. I 的 aal4_aa34)或K P A I X5X6L A X7X8G GV K X9I S G L I (SEQ IDNo. I的aa31_aa50)或其至少7个氨基酸长的功能片段，其中所述氨基酸X1-X9独立选自精氨酸残基或瓜氨酸残基，并且X1-X7中至少两个是瓜氨酸残基。
3.如权利要求I所述的肽，其特征在于，所述肽包含序列SG Cit G K G GK G L G K GG A K Cit H Cit K V L Cit D N I Q G I T K P A I Cit Cit L A Cit CitG G V K CitISGL I (SEQ ID No. I，其中所有X1-X9是瓜氨酸(CU)残基，式II)或其至少7个氨基酸长的功能片段。
4.如权利要求2所述的肽，其特征在于，所述肽包含选自下组的序列SGCit G K G GK G L G K G G A K Cit H Cit K (SEQ ID No. I 的 aal_aa20，其中 X1-X3 是瓜氨酸(Cit)残基)，G A K Cit H Cit K V L Cit D N I Q G I T K P A I(SEQ ID No. I 的 aal4_aa34，其中 X2-X4 是瓜氨酸(Cit)残基)，K P A I Cit Cit LA Cit Cit G G V K Cit I S G LI (SEQ ID No. I的aa31_aa50，其中X5-X9是瓜氨酸(CU)残基)或其至少7个氨基酸长的功能片段。
5.如前述权利要求中任一项所述的肽，其特征在于，所述肽是线形的。
6.如权利要求1-4中任一项所述的肽，其特征在于，所述肽是多亚基分支肽的形式。
7.如权利要求6所述的肽，其特征在于，所述肽包含4个如权利要求1-4所述肽的相同拷贝。
8.如权利要求7所述的肽，其特征在于，所述肽选自(S G Cit G K G G K G L G K G G A K Cit H Cit K) 4K2K ^ A, S G Cit G K G G K G L G K G G A K Cit H CitS G Cit G K G G K G L G K G G A K Cit H Cit \
9.如前述权利要求中任一项所述的肽，其特征在于，所述自体免疫疾病是类风湿性关节炎。
10.一种诊断对象中自体免疫疾病的方法，所述方法包含在生物样品中检测自体免疫疾病特异性抗体的步骤，通过 -合适条件下使所述生物样品与至少一种如权利要求1-9中任一项所述的肽反应以产生复合物； -检测所述复合物。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述生物样品与包含序列(GAK Cit H
12.如权利要求10或11中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法是免疫学试验。
13.一种自体免疫疾病的诊断药盒，所述药盒包括至少一种如权利要求1-9中任一项所述的肽，或其至少7个氨基酸长的功能片段。
14.如权利要求13所述的药盒,其特征在于,所述药盒包含所述序列(GAK Cit H Cit
15.如权利要求10所述的方法或权利要求13所述的药盒，其特征在于，所述自体免疫疾病是类风湿性关节炎。
16.针对如权利要求1-9中任一项所述的肽的抗体，所述抗体用于自体免疫疾病的诊断试验。
17.如权利要求16所述的抗体，其特征在于，所述自体免疫疾病是类风湿性关节炎。
全文摘要
本发明涉及衍生自组蛋白H4蛋白的瓜氨酸合成肽，和其在诊断自身免疫疾病特别是类风湿性关节炎(RA)中的应用。
文档编号G01N33/68GK102971339SQ201180031890
公开日2013年3月13日 申请日期2011年6月30日 优先权日2010年7月2日
发明者F·普拉泰西, M·C·阿尔卡洛, M·切利, F·罗利, I·宝里尼, A·M·帕皮尼, P·罗维霍, P·米廖里尼 申请人:托斯卡纳生物标志有限公司