一种重组转氨酶及其酶制剂和应用的制作方法

1.本发明涉及基因工程与酶工程技术领域，特别是涉及生物催化不对称合成手性中间体的技术领域，更为具体的说是涉及一种重组转氨酶及其酶制剂和应用。


背景技术：

2.转氨酶又称氨基转移酶，是一类磷酸吡哆醛依赖性的转移酶，在氨基供体存在下能够特异性地将氨基转移到底物酮上，得到相应的手性胺。作为一种绿色催化剂，转氨酶参与的转氨反应过程具有反应简单、绿色环保等优势。
3.转氨酶的催化活性与底物具有密切关系。通过对生物催化剂进行分子改造，提高天然酶在某种、某类合成中的催化性能，对于工业化酶法合成应用具有重要的意义。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是提供一种新的能够应用在如以式ii所示化合物制备式i所示替卡格雷手性中间体这类合成中的重组转氨酶，从而可以显著提高催化活性，高效制备获得目标化合物。
5.为了解决上述技术问题，本发明首先公开了一种重组转氨酶，该重组转氨酶的氨基酸序列如seq id no：1所示。
6.进一步地，本发明还公开了该重组转氨酶的编码核苷酸序列，所述编码核苷酸序列如seq id no：2所示。
7.进一步地，本发明公开了包含上述编码重组转氨酶的核苷酸序列seq id no：2的重组表达载体。
8.优选地，所述重组表达载体为pet-28a。
9.更进一步地，本发明还公开了重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含有包含上述编码转氨酶的核苷酸序列seq id no：1的重组表达载体。
10.优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)。
11.同时，本发明还公开了一种酶制剂，所述酶制剂中包含有前述氨基酸序列如seq id no：1所示的重组转氨酶。
12.进一步，本发明还公开了重组转氨酶的制备方法，将携带有如seq id no：2所示的编码核苷酸序列的重组菌接种至lb培养基中，37℃过夜培养，然后按照1％的接种量转接于lb培养基中，37℃培养至od600＝0.6～0.8时，加入iptg，18℃诱导16～20h，发酵结束后，离心收集获得湿菌体，清洗，超声波破碎获得重组转氨酶酶液。
13.最后，本发明还公开了前述转氨酶在催化酮类化合物转氨反应制备手性胺中的应用。特别地，所述酮类化合物是指式ii化合物或其类似化合物。
14.更为优选地是，所述转氨酶在制备替卡格雷手性中间体化合物的应用，合成工艺路线如下所示：
[0015][0016]
化合物i是以化合物ii为底物，以转氨酶为催化剂，在ph7.0-8.5的缓冲液为反应介质，助溶剂，氨基供体与plp参与的反应体系下反应，经分离、纯化获得。
[0017]
本发明利用基因工程技术，成功构建能够表达重组转氨酶的重组表达载体，该重组表达载体在宿主细胞内可以稳定存在并自主复制，通过该重组菌获得的转氨酶催化剂具有高效催化性和高选择性。利用重组转氨酶作为催化剂制备替卡格雷手性中间体化合物i时，手性选择ee值＞98％，化学纯度＞99％，是一种具有高催化效率和高手性选择的合成方法。
附图说明
[0018]
图1为转氨酶表达载体示意图。
具体实施方式
[0019]
为了更好地理解本发明，下面我们结合具体的实施例对本发明进行进一步的阐述。
[0020]
除非有特殊说明，在本发明实施例中所用试剂均为普通市售产品。
[0021]
实施例1
[0022]
将重组转氨酶的基因送上海生工基因合成后，选择表达载体为pet-28a(+)，通过ecor i和hind iii双酶切位点接入外源基因，如图1所示，将构建好的载体载入e.coli bl21(de3)中，kna抗性平板涂布筛选阳性克隆，并进行质粒提取和测序验证，最终确认获得含该酯酶基因的重组工程菌。其中，t-002的核苷酸序列如seq id no：1所示。
[0023]
实施例2重组转氨酶的制备
[0024]
将实施例1构建的重组菌接种于10ml的lb培养基中，37℃震荡培养过夜，按照1％的接种量转接于lb培养基中，37℃培养至od600＝0.6～0.8时，加入终浓度为0.5mm的iptg，20℃诱导16h，离心收集湿菌体，洗涤两次后超声波破碎后获得稀释的粗酶液。
[0025]
实施例3重组转氨酶在制备替卡格雷中间体化合物i中的应用
[0026]
在250ml的锥形瓶中分别加入9ml 0.2m ph7.0 pb buffer，0.1g异丙胺，10ml稀释粗酶液(约含1g湿菌体)，0.001gplp，1g底物，4ml的dmso，反应温度为40℃，220rpm，摇床催化过夜反应，底物完全转化后加入等体积乙酸乙酯萃取2次，取上层乙酸乙酯相。经液相检测，ee值为98.9％，进一步纯化后化学纯度约为99.2％。
[0027]
以上所述是本发明的具体实施方式。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。


技术特征：
1.一种重组转氨酶，其特征在于：该重组转氨酶的氨基酸序列如seq id no：1所示。2.一种编码权利要求1所述的重组转氨酶的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。3.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌种表达如seq id no：1所示的重组转氨酶。4.根据权利要求3所述的重组菌株，其特征在于：以pet-28a质粒为表达载体表达重组转氨酶。5.根据权利要求3或4所述的重组菌株，其特征在于：以大肠杆菌bl21(de3)为宿主细胞。6.根据权利要求5所述的重组菌株，其特征在于：所述重组菌株是将如seq id no：2所示的转氨酶基因连接到pet-28a质粒的ecor i和hind iii位点，然后转化到大肠杆菌bl21(de3)中形成。7.一种酶制剂，其特征在于：所述酶制剂中包含权利要求1所述的重组转氨酶。8.一种重组转氨酶的制备方法，其特征在于：将携带有如seq id no：2所示的编码核苷酸序列的重组菌接种至lb培养基中，37℃过夜培养，然后按照1％的接种量转接于lb培养基中，37℃培养至od600＝0.6～0.8时，加入iptg，18℃诱导16～20h，发酵结束后，离心收集获得湿菌体，清洗，超声波破碎获得重组转氨酶酶液。9.权利要求1所述的转氨酶在催化酮类化合物转氨反应制备手性胺中的应用，所述酮类化合物是指式ii化合物或其类似化合物，10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：，所述转氨酶在制备替卡格雷手性中间体化合物的应用，合成工艺路线如下所示：化合物i是以化合物ii为底物，以转氨酶为催化剂，在ph7.0-8.5的缓冲液为反应介质，助溶剂，氨基供体与plp参与的反应体系下反应，经分离、纯化获得。

技术总结
本发明涉及基因工程与酶工程技术领域，特别是涉及生物催化不对称合成手性中间体的技术领域，更为具体的说是涉及一种重组转氨酶及其酶制剂和应用。本发明利用基因工程技术，成功构建能够表达重组转氨酶的重组菌，利用所获得的重组转氨酶制备替卡格雷手性中间体化合物I，手性选择ee值可以达到98％，化学纯度＞99％，是一种具有高催化效率和高手性选择的合成催化剂。成催化剂。成催化剂。


技术研发人员：戚陈陈 邬小兵 龙海 何渊
受保护的技术使用者：重庆普佑生物医药有限公司
技术研发日：2022.11.09
技术公布日：2023/3/31