一种稀土依赖型醇脱氢酶突变体及其应用

1.本发明涉及酶工程技术领域，具体涉及一种稀土依赖型醇脱氢酶突变体及其应用。


背景技术：

2.为了获得性能优异的酶，人类不断探索发展改造蛋白质的方法，例如初级理性设计、定向进化以及半理性设计。近年来，随着计算机运算能力大幅提升、结构生物学、计算生物学和人工智能技术的飞速发展，计算机辅助蛋白质设计受到了极大的关注，已成为蛋白质工程新的重要方向。基于结构模拟与能量计算(如rosetta、foldx等)和基于机器学习(如mlde、mutcompute等)的蛋白质计算设计已取得瞩目的成绩。
3.醇氧化生成酮或醛是有机合成中的重要反应。与化学方法相比，醇的酶氧化是在温和条件下进行的，不使用任何有毒试剂，且往往具有较高的催化特异性和选择性，产生的副产物较少，因此一直是醇类绿色氧化的首选。醇脱氢酶(adhs)是常用的氧化酶。2012年，首个稀土依赖型醇脱氢酶xoxf被发掘报道，相比于同样以pqq为辅酶的钙依赖型醇脱氢酶，xoxf表现出更高的催化活性。不同于普通的金属离子，稀土元素独特的4f价电子结构，使其具有优异的光、电、磁与催化等性能。稀土离子电子跃迁、自旋耦合与轨道杂化等特性，可以为酶工程提供更多可能性。
4.一种来源于恶臭假单胞菌的稀土依赖型醇脱氢酶pedh，可在大肠杆菌中实现异源可溶表达，便于进行酶工程改造。有研究表明表达pedh的恶臭假单胞菌能够以乙醇作为唯一碳源生长。此外，pedh可以催化甲醇生成甲醛，而甲醇的氧化是一碳代谢的关键限速步骤，是天然甲基营养菌和人工甲基营养菌中不可或缺的一步。随着世界人口的快速增长和工业的迅速发展，资源短缺和环境污染问题已成为人类面临的巨大挑战，以一碳代谢为代表的绿色生物制造愈发受到关注。甲醇和甲烷等一碳化合物由于原料来源广泛，价格低廉，还原力高等优势，成为绿色生物制造大宗化学品的理想原料。
5.pedh能够催化5-羟甲基糠醛(hmf)生成5-羟甲基-2-呋喃甲酸(hfca)并进一步氧化成为5-甲醛基呋喃-2-羧酸(ffca)。ffca是2，5-呋喃二甲酸(fdca)的前体。fdca是一种重要的生物基平台化合物，具有作为对苯二甲酸(pta)的替代品用于合成可再生的聚2，5-呋喃二甲酸乙二醇酯(pef)的潜力，被广泛应用于生产多种生物基高分子聚合物，例如聚酰胺、聚酯和聚氨酯等。
6.然而，与大多数醇脱氢酶一样，pedh在催化氧化的过程中存在活性和稳定性较低的问题，这限制了其工业应用。因此，通过基于深度学习的mutcompute设计工具以及基于能量函数的foldx工具相结合的方法，确定稀土依赖型醇脱氢酶pedh的待突变位点，并通过筛选得到稳定性提高和/或对甲醇、乙醇、5-羟甲基糠醛活性提高的突变体具有重要意义。可促进一碳代谢的发展，改善资源短缺和环境污染问题，推进绿色生物制造fdca等重要化合物的研究。


技术实现要素：

7.为了解决来源于恶臭假单胞菌pseudomonas putida的原始稀土依赖型醇脱氢酶pedh的活性和稳定性较低的问题，本发明提供了一种稀土依赖型醇脱氢酶pedh突变体及其应用。
8.本发明使用基于深度学习的mutcompute在线设计工具对来源于pseudomonas putida的稀土依赖型醇脱氢酶pedh(氨基酸序列如seq idno.1所示，核苷酸序列如seq id no.2所示)的高性能突变体进行预测，获得一系列预测突变体，并使用基于能量函数的foldx工具计算各预测突变体的结合自由能变δδg。选取mutcompute预测得分最高的前10个突变体以及foldx计算的δδg最低的10个突变体进行定点突变。对该20种突变体进行培养表达和纯化，并使用酶标仪测定突变体对甲醇、乙醇和5-羟甲基糠醛的比酶活，然后使用蛋白质稳定性分析仪测定各突变体的溶解温度tm值，并通过组合突变，最终获得活性和/或稳定性提高的稀土依赖型醇脱氢酶pedh的突变体。
9.所述突变体为q207n、h486y、q207n/h486y。其中，q207n表示：第207位的氨基酸由谷氨酰胺突变为天冬酰胺；h486y表示：第486位的氨基酸由组氨酸突变为酪氨酸；q207n/h486y表示：第207位的氨基酸由谷氨酰胺突变为天冬酰胺且第486位的氨基酸由组氨酸突变为酪氨酸。
10.具体的技术方案如下：
11.本发明提供了一种稀土依赖型醇脱氢酶突变体，是由来自恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)的野生型醇脱氢酶进行突变而得，所述野生型醇脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.1所示，具体突变为(1)和/或(2)：
12.(1)第207位的氨基酸由谷氨酰胺突变为天冬酰胺；
13.(2)第486位的氨基酸由组氨酸突变为酪氨酸。
14.本发明还提供了所述的稀土依赖型醇脱氢酶突变体在催化甲醇生成甲醛、催化乙醇生成乙醛、或者催化5-羟甲基糠醛生成5-羟甲基-2-呋喃甲酸中的应用。
15.本发明还提供了编码所述稀土依赖型醇脱氢酶突变体的基因。
16.优选的，所述基因的核苷酸序列如seq id no.7、seq id no.8或seqid no.9所示。
17.本发明还提供了所述的基因在催化甲醇生成甲醛、催化乙醇生成乙醛、或者催化5-羟甲基糠醛生成5-羟甲基-2-呋喃甲酸中的应用。
18.本发明还提供了一种包含所述基因的表达载体。本发明使用的重组载体的原始表达载体为pet28a。
19.本发明还提供了一种表达所述稀土依赖型醇脱氢酶突变体的基因工程菌。本发明使用的基因工程菌的宿主细胞为e.coli bl21(de3)。
20.本发明还提供了所述的基因工程菌在催化甲醇生成甲醛、催化乙醇生成乙醛、或者催化5-羟甲基糠醛生成5-羟甲基-2-呋喃甲酸中的应用。
21.本发明还提供了一种甲醛、乙醛、或者5-羟甲基-2-呋喃甲酸的制备方法，使用所述稀土依赖型醇脱氢酶突变体催化甲醇、乙醇或者5-羟甲基糠醛发生氧化反应，制备得到甲醛、乙醛、或者5-羟甲基-2-呋喃甲酸。
22.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
23.(1)本发明以一种稀土依赖型醇脱氢酶为基础，使用基于深度学习的mutcompute
在线设计工具以及基于能量函数的foldx工具预测待突变位点，筛选得到活性和/或稳定性提高的突变体，解决了高稳定性和高活性无法兼顾的问题。其中，突变体q207n、h486y和组合突变体q207n/h486y对乙醇的比酶活分别是原始酶pedh的2.4、2.6、3.6倍，对甲醇的比酶活分别是原始酶pedh的2.3、2.8、3.6倍，对5-羟甲基糠醛的比酶活分别是原始酶pedh的2.3、2.6、2.8倍。其中，突变体h486y和组合突变体q207n/h486y在比酶活提高的同时，稳定性也有所提高，溶解温度tm值相比原始酶pedh分别提高2.3℃、2.2℃。
24.(2)本发明所使用的将mutcompute设计工具和foldx工具相结合的理性设计方法，能以较小的突变文库，通过筛选快速获得高稳定性和高活性的稀土依赖型醇脱氢酶突变体。
附图说明
25.图1为pedh蛋白表达纯化sds-page图；从左至右依次是m：maker，1：超滤液，2：洗脱液，3：流穿，4：上清。
26.图2为pedh野生型及q207n、h486y、q207n/h486y突变体对三种底物的比酶活图。
27.图3为pedh野生型及q207n、h486y、q207n/h486y突变体的tm值图。
具体实施方式
28.上游基因工程所用试剂：本发明实施例中使用的e.coli bl21(de3)、质粒pet28a等购自novagen公司；pedh的基因合成、引物合成与序列测序工作由擎科生物工程股份有限公司完成。
29.催化反应所用试剂：甲醇、乙醇、tris和盐酸购自国药集团化学试剂有限公司；pqq(吡咯喹啉醌)购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；氯化镨和5-羟甲基糠醛购自阿拉丁试剂(上海)有限公司；dcpip(2，6-二氯酚靛酚)购自上海麦克林生化科技有限公司；pes(吩嗪乙基硫酸盐)购自上海易恩化学技术有限公司。
30.酶活单位(u)的定义：反应体系中每分钟消耗1μm dcpip所需要的酶量。
31.实施例1
32.原始稀土依赖型醇脱氢酶重组菌的构建。
33.委托擎科生物工程股份有限公司合成原始稀土依赖型醇脱氢酶(氨基酸序列如seq id no.1所示)的基因序列，序列如seq id no.2所示，并插入到载体pet28a的酶切位点bamhi和hind iii之间，获得重组质粒pet28a-pedh。采用热激法将重组质粒转化入e.co，i bl21(de3)感受态细胞中，测序验证正确后获得原始稀土依赖型醇脱氢酶重组菌。
34.实施例2
35.稀土依赖型醇脱氢酶待突变位点的设计。
36.使用基于深度学习的mutcompute在线设计工具(https：//mutcompute.com/)对pedh的高性能突变体进行预测。具体地，登入网站注册用户后，输入pedh的pdb编号(6zcw)，点击predict，获得一系列预测的突变体。接着使用基于能量函数的foldx工具计算各预测突变体的结合自由能变δδg。结合mutcompute预测得分以及foldx计算的δδg值，筛选得到2个潜在突变位点。
37.实施例3
38.稀土依赖型醇脱氢酶突变体的构建。
39.根据实施例2中所获得的突变体设计引物，对pedh进行定点突变。
40.具体方法如下：
41.1、全质粒pcr
42.以pet28a-pedh质粒为模板，设计覆盖突变位点的上下游引物(表1)进行全质粒pcr。
43.表1定点突变构建所用引物
44.引物名称引物序列(5’to 3’)q207n-ftaatgcatataatccggaaaatggtgaactgcq207n-rccggattatatgcattaattttaccaacaacaccaaattcah486y-fgaagtttggcgttataaaaattatgcaccgctgtggh486y-rttataacgccaaacttctttaccgctaaccgg
45.pcr扩增体系：
46.dna聚合酶25μl，
47.上游引物(10μm)1μl，
48.下游引物(10μm)1μl，
49.模板(5ng/μl)1μl，
50.ddh2o22μl。
51.pcr扩增条件：
52.1)预变性：98℃ 3min；
53.2)变性：98℃ 10s；退火：60℃ 15s；延伸：72℃ 1min；共循环33次；
54.3)后延伸：72℃ 5min；
55.4)4℃保存。
56.2、转化及验证
57.采用热激法将上述pcr产物直接转化入e.coli bl21(de3)感受态细胞中，测序验证正确后获得稀土依赖型醇脱氢酶突变菌株，命名为突变菌株q207n(编码稀土依赖型醇脱氢酶突变体的核苷酸序列如seq id no.7所示)、突变菌株h486y(编码稀土依赖型醇脱氢酶突变体的核苷酸序列如seq id no.8所示)和突变菌株q207n/h486y(编码稀土依赖型醇脱氢酶突变体的核苷酸序列如seq id no.9所示)。
58.实施例4
59.菌株培养及蛋白表达与纯化。
60.挑取实施例3中测序正确的重组菌(原始稀土依赖型醇脱氢酶重组菌和稀土依赖型醇脱氢酶突变菌株)单菌落于5ml lb液体培养基中(含50μg/ml卡那霉素)，37℃振荡培养12h。按2％的接种量转接至50ml含50μg/ml卡那霉素和10g/l α-乳糖的lb液体培养基中，30℃振荡培养12h。
61.培养结束后，将菌液4000
×
g 4℃离心15min，弃上清，收集菌体。用100mm ph 8.0的tris-hcl缓冲液洗涤菌体后，重悬于tris-hcl缓冲液中，置于冰水浴中进行超声破胞至澄清。对破胞液8000
×
g 4℃离心20min，取上清液用镍柱进行亲和层析，用洗杂缓冲液(100mm tris-hcl缓冲液，150mm nacl，50mm咪唑，ph 8.0)洗去杂质，用洗脱缓冲液
(100mmtris-hcl缓冲液，150mm nacl，250mm咪唑，ph 8.0)洗脱目的蛋白，将分离出来的目标蛋白置于超滤离心管中进行充分的脱盐浓缩，得到纯的目标蛋白，sds-page检测，结果如图1所示。第1泳道(超滤液)、第2泳道(洗脱液)和第4泳道(上清)在55kda～70kda之间存在明显的蛋白条带，这与pedh的理论蛋白分子量(63.0kda)相符，表明pedh的纯化成功。
62.实施例5
63.稀土依赖型醇脱氢酶的酶活测定。
64.用酶标仪定量分析反应体系中消耗的dcpip的量，通过计算得到原始稀土依赖型醇脱氢酶和稀土依赖型醇脱氢酶突变体对底物甲醇、乙醇和5-羟甲基糠醛的比酶活。反应体系包含适量的酶液、1.5μm pqq、1.5μmprcl3、15mm底物，总体系为200μl。反应介质为tris-hcl缓冲液(100mm，ph 8.0)，其中含有1mm pes和150μm dcpip。比酶活测定结果见图2，突变体q207n、h486y和组合突变体q207n/h486y对三种底物的比酶活相比原始酶pedh明显提升。原始酶pedh对乙醇、甲醇和5-羟甲基糠醛的比酶活分别是0.433u/mg、0.088u/mg、0.053u/mg。而突变体q207n、h486y和组合突变体q207n/h486y对乙醇的比酶活分别是原始酶pedh的2.4、2.6、3.6倍，对甲醇的比酶活分别是原始酶pedh的2.3、2.8、3.6倍，对5-羟甲基糠醛的比酶活分别是原始酶pedh的2.3、2.6、2.8倍。
65.实施例6
66.稀土依赖型醇脱氢酶的tm值测定。
67.将原始稀土依赖型醇脱氢酶和稀土依赖型醇脱氢酶突变体的酶液浓度统一调整至10μm，并添加至高精度石英玻璃毛细管组中，使用蛋白质稳定性分析仪(prometheus nt.plex)测定tm值，测定结果见图3，可以看到，突变体q207n与野生型pedh的溶解温度tm值没有明显区别，但突变体h486y和组合突变体q207n/h486y的稳定性有所提高，溶解温度tm值相比野生型pedh(63.7℃)分别提高2.3℃、2.2℃。