一种粉防己4’-氧甲基转移酶4’-OMT及应用

本发明涉及一种粉防己4’-氧甲基转移酶4’-omt的克隆表达及应用，并公开了其核苷酸序列、氨基酸序列、其酶学性质，属于生物工程。

背景技术：

1、苄基异喹啉生物碱具有结构和活性多样性，是天然产物领域研究的热点之一。药理学研究表明苄基异喹啉大多活性优异，如罂粟中得到的罂粟碱有解痉作用；粉防己中的汉防己甲素具有防治肝纤维化及抗埃博拉病毒的活性；莲子心中的莲心碱具有广谱的抗心律失常作用。此外，镇痛药吗啡和可待因、抗菌活性的小糵碱和血根碱、止咳药诺斯卡品等已成为临床一线使用的药物。目前药用苄基异喹啉生物碱的获取方式以植物提取为主，但存在苄基异喹啉生物碱含量低、提取废物污染环境、成本高等问题。

2、虽然结构复杂多样，但苄基异喹啉生物碱生物合成途径的起始步骤却十分相似。以酪氨酸的代谢产物多巴胺和4-羟基-苯乙醛为底物，经去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-氧甲基转移酶、乌药碱-氮-甲基转移酶、氮甲基乌药碱3’-羟化酶和4’-氧甲基转移酶等多个酶依次催化合成苄基异喹啉类生物碱的共同中间体——牛心果碱((s)-reticuline)。随后通过异构、偶联、重排、甲基化、去甲基化等反应，形成不同骨架类型的苄基异喹啉类生物碱，如吗啡、可待因、小檗碱、血根碱以及罂粟碱等。

3、4’-氧甲基转移酶(3′-hydroxy-n-methylcoclaurine 4’-o-methyltransferase，ec2.1.1.116,4’-omt)可以催化3’羟基n甲基乌药碱形成牛心果碱，是苄基异喹啉生物碱合成过程中的关键限速酶。因此，挖掘催化活性高，底物特异性强的4’-氧甲基转移酶是提高苄基异喹啉生物碱含量的迫切现实需要。

技术实现思路

1、本发明目的在于从药用植物粉防己中分离和鉴定了一条新的4’-氧甲基转移酶基因，并将其命名为st4’-omt，利用大肠杆菌对该基因进行异源重组表达蛋白，并公开了其酶学性质及其应用。

2、本发明采用的技术方案是：

3、一种粉防己4’-氧甲基转移酶4’-omt，具有如seq id no.2所示的氨基酸序列。

4、所述的粉防己4’-氧甲基转移酶4’-omt的编码基因，具有如seq id no.1所示的核苷酸序列。

5、一种粉防己4’-氧甲基转移酶重组质粒，所述重组质粒中包括所述的粉防己4’-氧甲基转移酶的编码基因。

6、进一步地，所述重组质粒中的原核表达载体为pet28a。所述重组质粒pet28a-st4’-omt的序列如seq id no.4所示，其中原核表达载体pet28a的序列如seq id no.3所示。其中，构建重组质粒pet28a-st4’-omt时，先提取粉防己rna，并将其反转录获得全基因组cdna。设计4’-氧甲基转移酶基因st4’-omt的特异性引物，扩增得到4’-氧甲基转移酶基因st4’-omt全长编码框序列，将扩增得到的4’-氧甲基转移酶基因st4’-omt全长编码框序列与双酶切后的pet28a质粒片段进行同源重组连接从而构建得到重组表达质粒pet28a-st4’-omt。

7、进一步地，4’-氧甲基转移酶基因st4’-omt的特异性引物如seq id no.5、seq idno.6所示。

8、一种粉防己4’-氧甲基转移酶重组菌株，所述重组菌株包含所述重组质粒的表达载体。

9、进一步地，通过如下方法构建：

10、通过将4’-氧甲基转移酶基因st4’-omt构建至原核表达载体pet28a中得到重组质粒pet28a-st4’-omt，将阳性重组质粒pet28a-st4’-omt转入bl21(de3)感受态细胞中组成重组菌株。重组菌株在诱导剂iptg的诱导下表达出可溶性蛋白-4’-氧甲基转移酶st4’-omt。

11、一种所述粉防己4’-氧甲基转移酶或所述粉防己4’-氧甲基转移酶重组菌株在苄基异喹啉生物碱催化反应中的应用。

12、所述应用具体为：催化3’羟基-氮甲基乌药碱反应合成牛心果碱。

13、进一步地，反应体系中还包含辅因子s-腺苷甲硫氨酸，浓度优选为0.1mmol·l-1。

14、进一步地，所述催化反应的温度为16～45℃，ph为4.0～10.0。

15、进一步地，所述催化反应的最适温度为30℃，最适ph为8.0。

16、进一步地，所述粉防己4’-氧甲基转移酶重组菌株催化3’羟基-氮甲基乌药碱反应合成牛心果碱之前，所述粉防己4’-氧甲基转移酶重组菌株在iptg溶液条件下进行诱导表达。iptg溶液的浓度优选为0.4mmol·l-1。

17、本发明的有益效果是：从药用植物粉防己中鉴定出一条新的4’-氧甲基转移酶st4’-omt，为进一步解析该药用植物中关键酶基因参与调控苄基异喹啉生物碱的合成奠定了一定的研究基础。相比于其他植物来源的4’-氧甲基转移酶，本发明的4’-氧甲基转移酶st4’-omt具有更高的底物特异性，催化效率更高，因此具有一定的应用价值。

技术特征：

1.一种粉防己4’-氧甲基转移酶4’-omt，其特征在于，具有如seq id no.2所示的氨基酸序列。

2.权利要求1所述的粉防己4’-氧甲基转移酶4’-omt的编码基因，其特征在于，具有如seq id no.1所示的核苷酸序列。

3.一种粉防己4’-氧甲基转移酶重组质粒，其特征在于，所述重组质粒中包括权利要求2所述的粉防己4’-氧甲基转移酶的编码基因。

4.一种粉防己4’-氧甲基转移酶重组菌株，其特征在于，所述重组菌株包含权利要求3所述重组质粒的表达载体。

5.权利要求1所述粉防己4’-氧甲基转移酶或权利要求4所述粉防己4’-氧甲基转移酶重组菌株在苄基异喹啉生物碱催化反应中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用具体为：催化3’羟基-氮甲基乌药碱反应合成牛心果碱。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，反应体系中还包含辅因子s-腺苷甲硫氨酸。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，催化反应的温度为16～45℃，ph为4.0～10.0。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述粉防己4’-氧甲基转移酶重组菌株催化3’羟基-氮甲基乌药碱反应合成牛心果碱之前，所述粉防己4’-氧甲基转移酶重组菌株在iptg溶液条件下进行诱导表达。

技术总结
本发明公开了一种粉防己4’‑氧甲基转移酶4’‑OMT及应用，本发明从药用植物粉防己中分离和鉴定了一条新的4’‑氧甲基转移酶，再利用大肠杆菌对该基因进行异源重组表达蛋白，该药用植物中关键酶基因参与调控苄基异喹啉生物碱的合成，奠定了一定的研究基础。相比于其他植物来源的4’‑氧甲基转移酶，本发明的4’‑氧甲基转移酶St4’‑OMT具有更高的底物特异性，催化效率更高，因此具有一定的应用价值。

技术研发人员：开国银,李坤伦,冯岳,张剑波
受保护的技术使用者：浙江中医药大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13