一株蛋白质谷氨酰胺酶生产菌株及其生产方法和应用

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一株蛋白质谷氨酰胺酶生产菌株及其生产方法和应用。

背景技术：

1、蛋白质谷氨酰胺酶(pg)是一种新型蛋白质水解酶，能够特异性地水解蛋白质谷氨酰胺残基的酰胺基，其可以有效提高蛋白质的溶解性、起泡性和乳化性等多种食品加工特性，因此在食品工业中具有广阔的应用前景。

2、蛋白质谷氨酰胺酶(pg)最初在2000年由日本学者利用cbz-gln-gly作为唯一氮源，从土壤中筛选出一株产蛋白质脱酰胺酶的菌株chryseobacterium proteolyticum9670t，但酶活很低，仅有0.258u/ml(yamaguchi s,yokoe m.a novel protein-deamidating enzyme from chryseobacterium proteolyticum sp.nov.,a newlyisolated bacterium from soil.applied and environmental microbiology,2000,66(8):3337-3343)。而国内对于蛋白质谷氨酰胺酶的研究起步较晚，蛋白质谷氨酰胺酶的产生菌株酶活也很低，远远达不到工业化生产要求，如张艳芳等报道筛选到了多个产pg酶的菌株，最高酶活0.717u/ml(张艳芳,贾彩凤,何灿,等.蛋白质谷氨酰胺酶产生菌的分离筛选和鉴定.食品工业科技,2015,36(1):170-176.)，康立等对产吲哚金黄杆菌发酵pg酶的条件及碳源氮源进行优化，最高酶活为0.594u/ml(康立,牛延宁,张艳芳,等.蛋白质谷氨酰胺酶的发酵及初步分离和应用研究[j].中国生物工程杂志,2014,34(5):54-59.)，何灿等采用正交实验设计优化pg酶发酵培养基配方，最高酶活为0.661u/ml(何灿,宋佳雯,黄迪,等.蛋白质谷氨酰胺酶发酵条件的初步优化[j].江苏农业科学,2014,42(03):218-220.)。黄静等公开了一株解朊金黄杆菌yf810，采用添加沸石，最高酶活为2u/ml(黄静等，蛋白质谷氨酰胺酶产生菌及发酵产物的制备与应用，授权公告号cn 107325978 b)；黄静等公开了一株解朊金黄杆菌a4142，最高酶活为2.15u/ml(黄静等，一种蛋白质谷氨酰胺酶生产菌株、筛选、及特性分析方法，专利申请号202010927185.6)，远达不到应用于工业化生产的要求。工业化生产蛋白质谷氨酰胺酶，生产成本是首要考虑的因素。目前公开文献显示，种子培养基成分中的氮源为多聚蛋白胨等高成本培养基。如康立等和何灿等报道种子培养基和发酵培养基氮源均为多聚蛋白胨(康立,牛延宁,张艳芳,等.蛋白质谷氨酰胺酶的发酵及初步分离和应用研究[j].中国生物工程杂志,2014,34(5):54-59，何灿,宋佳雯,黄迪,等.蛋白质谷氨酰胺酶发酵条件的初步优化[j].江苏农业科学,2014,42(03):218-220)。黄静等公开专利种子培养基配方和发酵培养基配方氮源也均为多聚蛋白胨(黄静等，一种蛋白质谷氨酰胺酶生产菌株、筛选、及特性分析方法，专利申请号202010927185.6)。由于多聚蛋白胨价格昂贵，仅仅用于实验室研究，不能用于工业化生产。

技术实现思路

1、本发明提供一株所产蛋白质谷氨酰胺酶活性较高的解朊金黄杆菌菌株。本发明通过对蛋白质谷氨酰胺酶生产菌株采取诱变育种技术，通过多轮ntg诱变、初复筛，获得一株高产菌株，解朊金黄杆菌(chryseobacterium proteolyticum)0326-509，该菌株具有酶活高的优点，即具有发酵酶活高特点的蛋白质谷氨酰胺酶生产菌株(chryseobacteriumproteolyticum)0326-509。该菌株为革兰氏阴性细菌，不产芽孢，不运动，菌落呈圆形，金黄色或橘黄色。

2、所述蛋白质谷氨酰胺酶生产菌株，为解朊金黄杆菌(chryseobacteriumproteolyticum)0326-509，保藏信息如下：

3、保藏时间：2022年8月26日

4、保藏单位名称：中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

5、保藏编号：cgmcc no.25600

6、保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所

7、分类命名：解朊金黄杆菌(chryseobacterium proteolyticum)

8、本发明所述解朊金黄杆菌0326-509，其在lb平板上的形态特征如下：菌落呈圆形，突起，边缘整齐，金黄色或橘黄色，表面光滑、有粘性。

9、本发明所述解朊金黄杆菌0326-509菌株主要生理生化特征如表1所示：

10、表1：0326-509细胞形态和生理生化特征

11、

12、

13、本发明所述解朊金黄杆菌杆菌0326-509的16s rdna序列如以下的seq id no:1所示：

14、tacctaggcagctcctgttacggtcaccgacttcaggtaccccagacttccatggcttgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcgccatggctgatgcgcgattactagcgattccagcttcatagagtcgagttgcagactccaatccgaactgagaccagctttcgagattagcatccagtcgcctggtagcagccctctgtactggccattgtattacgtgtgtggcccaaggcgtaagggccgtgatgatttgctatccccaccttcctctctacttgcgtaggcagtctcactagagtccccaactgaatgatggcaactagtgacaggggttgcgctcgttgcaggacttaacctaacacctcacggcacgagctgacgacaaccatgcagcaccttgaaaaatgtccgaagaaaagcctatttctaagcctgtcatttcccatttaagccttggtaaggttaatcgcgtatcatcgaattaaaccacataatccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcaaacttgcgttcgtactccccaggtggctaacttatcactttcgcttagtctctgaatccgaaaacccaaaaacgagttagcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgtccatcagcgtcagttaagacatggtaacctgccttcgcaattggtgttctaagtaatatctatgcatttcaccgctacactacttattccagctacctctaccttactcaagacccgcagtatcaatggcagtttcatagttaagctatgagatttcaccactgacttacgagtccgcctacggaccctttaaacccaataaatccggataacgcttgcaccctccgtattaccgcggctgctggcacggagttaaccggtgcttattcgtatagtaccttcagctaccctcacgagggtaggtttatccctatacaaaagaagtttacaacccatagggccgtcatccttcacgcgggatggctggatcaggctctcacccattgtccaatattcctcactgctgcctcccgtaggagtctggtccgtgtctcagtaccagtgtgggggatcaccctctcaggccccctaaagatcattgacttggtgagccgttacctcaccaactatctaatcttgcgcgtgcccatctctatccaccggagttttcaatatctaatgatgccatcaaatatattatggggtattaatcttcctttcgaaaggctatccccctgataaaggtaggttgcacacgtgttccgcacccgtgcgccgctctctagatcccgaaagatctat(seq id no：1)

15、本发明还提供优化利用所述解朊金黄杆菌(chryseobacterium proteolyticum)0326-509菌株发酵制备蛋白质谷氨酰胺酶的方法。

16、所述制备方法通过下述技术方案实现：

17、(1)菌株活化：取-80℃下保存的蛋白质谷氨酰胺酶生产菌株即解朊金黄杆菌(chryseobacterium proteolyticum)0326-509菌株的菌液划线于lb平板上，倒置于恒温培养箱中活化。

18、(2)种子液制备：采用接种环刮取lb平板中活化的菌体于装有灭菌的种子培养基的三角瓶中，置于恒温摇床中培养。

19、(3)发酵：活化后的种子液接入装有灭菌的发酵培养基的三角瓶中，置于恒温摇床中发酵，制备得到蛋白质谷氨酰胺酶。

20、所述步骤(1)中，菌液的量是80-120μl，优选为100μl；培养温度是30-40℃，优选为37℃；培养时间是15-18h，优化为16h。

21、所述步骤(2)中，接种环直径是2-4mm，优选为3mm；菌体量是1-4环，优选为3环；种子培养基装液量是20-30ml，优选为25ml；摇床温度是28-37℃，优选为30℃；摇床转速是180-250rpm，优选为200rpm；培养时间是6-10h，优选为8h。

22、所述步骤(2)中，种子培养基成分是安琪酵母蛋白胨fp103 8-12g/l，安琪酵母粉fm802 1.8-2.2g/l，七水硫酸镁2-2.2g/l，ph6.8-7.2。优选为：安琪酵母蛋白胨fp103 10g/l，安琪酵母粉fm802 2g/l，七水硫酸镁2.05g/l，ph7.0。

23、所述步骤(3)中，种子液的接种量是5-10％(v/v)，优选为7％(v/v)；发酵培养基装液量为20-30ml，优选为25ml；发酵温度是28-37℃，优选为30℃；摇床转速是180-250rpm，优选为200rpm；培养时间是14-18h，优选为16h。

24、所述步骤(3)中，发酵培养基的组成是：安琪酵母蛋白胨fp103 18-22g/l，磷酸二氢钾4.8-5.0g/l，磷酸氢二钠0.15-0.18g/l，七水硫酸镁6.7-6.8g/l，七水硫酸亚铁0.04-0.06g/l。优选为：安琪酵母蛋白胨fp103 20g/l，磷酸二氢钾4.89g/l，磷酸氢二钠0.17g/l，七水硫酸镁6.75g/l，七水硫酸亚铁0.05g/l。

25、所述方法制备得到的蛋白质谷氨酰胺酶为作用温和、特异性高、安全可食用的新型蛋白酶，其活性可达7.0u/ml。

26、本发明还提供了采用所述方法生产制备得到的蛋白质谷氨酰胺酶。

27、本发明还提供了一种可以用于工业化生产蛋白质谷氨酰酶的种子培养基配方和发酵培养基配方。

28、所述种子培养基的组成为：安琪酵母蛋白胨为8-12g/l，安琪酵母粉为1.8-2.2g/l，七水硫酸镁为2-2.2g/l；ph＝6.8-7.2。

29、所述发酵培养基的组成为：安琪酵母蛋白胨为18-22g/l，磷酸二氢钾为4.8-5.0g/l，磷酸氢二钠为0.15-0.18g/l，七水硫酸镁为6.7-6.8g/l，七水硫酸亚铁为0.04-0.06g/l。

30、优选地，在本发明方法中应用了本发明所述高产菌株、种子培养基、发酵培养基，使得生产制备得到的发酵上清液酶活达到7.0u/ml，可以实现蛋白质谷氨酰胺酶的工业化规模生产。

31、本发明还提出了所述蛋白质谷氨酰胺酶生产菌株即解朊金黄杆菌(chryseobacterium proteolyticum)0326-509、以及所述利用该菌株的生产制备方法在制备蛋白质谷氨酰胺酶中的应用。

32、本发明的有益效果包括：本发明蛋白质谷氨酰胺酶生产菌株0326-509属于解朊金黄杆菌属，并且通过传统的诱变育种方法获得，是食品安全生产菌株；

33、且，本发明提出了一种新的种子培养基配方和发酵培养基配方，其中，种子培养基配方主要氮源为安琪酵母蛋白胨fp103和安琪酵母粉fm802，发酵培养基配方主要氮源为安琪酵母蛋白胨fp103。这两种氮源均为工业化原料，适合工业化发酵且极大幅度地降低了工业化成本。

34、且，利用本发明的发酵培养基对菌株0326-509进行发酵制备蛋白质谷氨酰胺酶，发酵上清液酶活可达7.0u/ml，远高于目前国内公开报道的可食用菌株所产的蛋白质谷氨酰胺酶发酵酶活，可以实现工业化生产。

35、本发明提出采用工业化氮源安全酵母蛋白胨和安琪酵母粉。不仅价格便宜，而且非常适合本发明提出的解朊金黄杆菌0326-509发酵生产蛋白质谷氨酰胺酶，发酵酶活达到7.0u/ml。可以实现工业化生产。

36、本发明创新提出，通过大幅度提高发酵培养基中七水硫酸镁的含量达6.7-6.8g/l，优选地为6.75g/l，可以有效提高产酶活性。这可能是由于镁离子是多种酶的激活剂，对酶有激活作用。本发明提高发酵培养基中的七水硫酸镁含量的新思路，可以有效地提高蛋白质谷氨酰胺酶生产菌株0326-509的发酵酶活，为提高产酶活性提供了实质进步的技术突破。而目前现有技术中及公开文献中发酵培养基的七水硫酸镁的含量都较低，如苟万晓等报道的产木聚糖酶发酵培养基的七水硫酸镁含量为2.2g/l(苟万晓，范延期，胡元森等，甲醇蛋白联产木聚糖酶发酵培养基优化[j]，轻工学报，2021,36(04)：1-8)，张桃桃等报道的产柚苷酶发酵培养基的七水硫酸镁含量为2.0g/l(张桃桃，张平，牛春等，黑曲霉菌发酵产柚苷酶培养基配方的优化研究[j]，安徽农业科学，2021,49(07)：170-173+176)，刘德海等报道的高产α-半乳糖苷酶的发酵培养基中七水硫酸镁的含量1.0g/l(刘德海，权淑静等，高产α-半乳糖苷酶菌株的筛选鉴定及发酵培养基的优化[j]，中国酿造，2019,38(12)：80-86)。