一种平菇-反硝化光合菌-小球藻共生体系的制备方法及其应用

1.本发明属于水产养殖领域，具体涉及一种平菇-反硝化光合菌-小球藻共生体系的制备方法及其应用。


背景技术：

2.近年来工厂化海水养殖发展迅猛。为减少水生动物病害，保障正常生长，工厂化养殖过程中会定期排放掉一定量的富含氮、磷等物质的养殖水，并补充等量的新鲜水。这些富含氮、磷的尾水直接排入河、海等自然水系极易导致富营养化，威胁人类的健康。为此国家出台法律，规定这类水必须处理达标后才能排放。
3.水产养殖尾水在水质特征上与污水厂所处理的市政污水相比存在明显差异，主要体现在污染物成分组成较为简单、种类相对固定、浓度低等。针对水产养殖尾水的水质特点，常用的处理方法是生物强化氧化塘法，即将尾水泵入集污池，通过投加外源功能菌联合水中的内源微生物进行净化处理，经过一级或多级氧化塘处理达标后排放。该方法具有费用低、可原位处理、无二次污染等优点。然而对于直接投加菌剂法，处理结束后随着每次排水都会造成功能菌群的大量流失。虽然采用多次间歇投加的方法能缓解菌群流失对处理效果造成的影响，但是会消耗更多的人力、物力及时间，降低经济效益。
4.针对上述所面临的菌群流失问题，研究者尝试采用固定化的方式来增强功能菌群在系统中的稳定性，延长有效菌群在系统内的停留时间，提高系统的处理能力。对于微生物固定化，以载体结合法最为常用也比较经济。其中，载体以砂石、陶粒、活性炭等最为多见。但是，这类载体投入集污池后会按照密度分层且以堆积的方式存在于水处理系统中，导致功能菌的作用不能完全发挥，降低了处理效率。


技术实现要素：

5.本发明针对水产养殖尾水直投菌剂强化处理功能菌群流失和降解速率慢等问题，提供了一种平菇-反硝化光合菌-小球藻共生体系的制备方法。
6.本发明还提供了一种上述平菇-反硝化光合菌-小球藻共生体系在强化水产养殖尾水处理中的应用。
7.本发明通过如下技术方案实现：本发明提供了一种平菇-反硝化光合菌-小球藻共生体系的制备方法，包括下述步骤：（1）反硝化光合细菌的培养：活化好的反硝化光合细菌种子接种光合细菌发酵培养基，进行培养，得反硝化光和细菌培养液；（2）真菌菌丝球的制备，将平菇菌苔点接于固体pda培养基培养3-5天至长出菌苔，取带有固体pda培养基的菌苔接种100-200 ml菌丝球成球培养基，培养后得到菌丝球培养液；
（3）将藻种接种光合细菌发酵培养基，培养后得小球藻培养液；（4）平菇-反硝化光合菌-小球藻共生体系构建，先将菌丝球培养液与光合细菌培养液比例混合，进行共培养，得到平菇-反硝化光合菌共生体系，之后将培养的小球藻培养液与平菇-反硝化光合菌共生体系按比例混合，进行共培养，最终得到平菇-反硝化光合菌-小球藻共生体系；（5）平菇-反硝化光合菌-小球藻共生体系收集：平菇-反硝化光合菌-小球藻共生体系构建结束后，室温或冷藏（≤10℃）静置，去除上清，收集到的菌体材料，用一定体积无菌的新鲜光合细菌发酵培养基重悬即可。
8.进一步的，步骤（1）中，所述反硝化光和细菌种子的接种量为2%；所述培养为在25-32℃、150-200 r/min培养48-120 h，使吸光度od
600
大于5，使培养基活菌数达到3
×
10
9 cfu/ml以上。
9.进一步的，步骤（1）中，所述光合细菌发酵培养基的组成为：称取葡萄糖3 g，酵母粉8 g，氯化钠2 g、硫酸镁0.125 g，磷酸二氢钾1.3 g，并加入1 ml生长因子母液，加去离子水至1 l，调节ph至7.2-7.4。若需固体培养基，向其添加2%（w/w）的琼脂粉，121 ℃灭菌20 min。所述菌丝球成球培养基的组成为：称取葡萄糖30 g，酵母粉3 g，磷酸二氢钾1 g，硫酸镁0. 5 g，并加入维生素b
1 0.01 g，加去离子水至1 l，ph自然。
10.进一步的，步骤（2）中，所述菌苔的直径为0.5-1 cm；所述培养为在28-32℃条件下、100-150 r/min培养5-10 d，使菌丝球直径在2-4 mm，干重达到8 g/l以上。
11.进一步的，步骤（3）中，所述培养为在28℃、140 r/min培养120 h，使吸光度od
600
大于2。
12.进一步的，步骤（4）中，所述菌丝球培养液与光合细菌培养液的体积比为1-5：10-20；所述平菇-反硝化光合菌共生体系与小球藻培养液的体积比为1：1。
13.进一步的，步骤（4）中，所述共培养为在25-32℃、150-200 r/min共培养24-48 h，使吸附量≥10
10 cfu（细菌）/g（菌丝球）。
14.进一步的，步骤（5）中，所述静置的时间为12-24 h；所述重悬用新鲜光合细菌发酵培养基体积为平菇-反硝化光合菌-小球藻共生体系收集时悬液的1/4-1/8。
15.本发明还提供了一种利用上述制备方法制备得到的平菇-反硝化光合菌-小球藻共生体系在连续处理水产养殖尾水中的应用。
16.进一步的，具体包括以下步骤：将平菇-反硝化光合菌-小球藻共生体系以1g:1-10l尾水的比例投入集污池，在自然昼夜交替的情况下处理5-7 d，温度25-32℃，处理过程中无需通气，处理快结束时分析污染评价指标的去除量，如果达标则将处理后的水通过浮网排出，之后泵入下批次尾水；如未达标则延长处理时间，直至达标后排放。
17.本发明所使用的的平菇为白平菇或灰平菇。
18.平菇（pleurotus ostreatus）安全可食用，在深层液体培养条件下能够形成形状趋于球体，内部中空，表面致密的菌丝球。
19.固氮红细菌（rhodobacter azotoformans）属于紫色非硫光合细菌，安全无毒，广泛用于水产养殖水体的水质调节。固氮红细菌atcc 17025具有完整的反硝化代谢酶系，能将硝态氮最终转化为氮气，实现脱氮。通常细菌反硝化作用在低氧或缺氧的条件下才能发挥最大性能。
20.小球藻（chlorella vulgaris）为绿藻门小球藻属普生性单细胞绿藻，具有调节水质，降低氨氮、亚硝酸盐，抑制蓝藻，改善水体环境。小球藻可作为虾蟹贝幼苗的开口饵料，滤食性鱼类的的直接饲料，促进生长、降低成本，提高水产动物的成活率。另外，小球藻进行光合作用，增加水体溶氧，大大减少缺氧浮头的可能。
21.本发明采用平菇菌丝球作为生物载体依次固定反硝化光合菌和小球藻，制备平菇-反硝化光合菌-小球藻共生体系，并将该体系用于强化水产养殖尾水处理。
22.本发明的有益效果为：本发明提供了一种平菇-反硝化光合菌-小球藻共生体系强化水产养殖尾水处理的方法，处理时间缩短，效率提高，改善直投菌剂处理结束后功能菌群流失的问题。
附图说明
23.图1为固氮红细菌反硝化性能分析图；图2为固氮红细菌聚磷性能分析图；图3为平菇菌丝球图片；图4为平菇-反硝化光合菌-小球藻共生体系图片。
具体实施方式
24.下面结合实施例对本发明详细说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
25.图1为固氮红细菌反硝化性能分析图；图2为固氮红细菌聚磷性能分析图。
26.实施例1（1）平菇-反硝化光合菌-小球藻共生体系制备：固氮红细菌在光合细菌培养基固体斜面划线后在30℃恒温培养至长出红色的菌苔，取一小环固氮红细菌斜面菌苔在光合细菌固体种子培养基上划线获得单菌落，挑取单菌落接种光合细菌液体种子培养基，150 r/min、30℃活化培养至od
600
大于0.8，取活化好的菌种以2%（v/v）接种光合细菌发酵培养基，在30℃、150 r/min培养72 h，吸光度od
600
达到6，培养基活菌数达到4
×
10
9 cfu/ml。
27.在平菇菌棒外袋剪出一直径约为3 cm的圆形区域，并用酒精球擦拭表面，用无菌的手术刀切开菌棒表面，切开后将表面丢弃不用，去除最外围菌棒后，选取没有出现菌丝或菌丝不明显的区域，用镊子夹取2-3粒（直径5 mm左右），放于pda培养基30℃恒温箱培养，至菌丝生长区域占据固体平板1/2即可，将生长有菌丝的菌苔转接至pda上30℃培养，获得纯种菌株的菌苔。
28.取10个直径0.5 cm的带有pda固体培养基的平菇菌苔接种菌丝球成球培养基，在28℃条件下、120 r/min避光培养7 d，使菌丝球直径达到3 mm，干重达到8.6 g/l。
29.将平菇菌丝球培养液与固氮红细菌培养液按5：20比例（v/v）混合，在30℃、150 r/min共培养24 h，使吸附量为1
×
10
10 cfu（细菌）/g（菌丝球）。
30.将藻种接种光合细菌发酵培养基，在28℃、140 r/min培养120 h，使吸光度od
600
大于2。
31.将平菇-反硝化光合菌共生体系与小球藻培养液按1：1比例（v/v）混合，在28℃、
150 r/min共培养48 h使吸附量≥10
6 个（小球藻）/g（菌丝球），获得平菇-反硝化光合菌-小球藻共生体系；平菇-反硝化光合菌-小球藻共生体系构建结束后，室温静置24 h，纱布过滤去除上清，收集到的菌体材料用收集时原菌液体积1/5的无菌的新鲜光合细菌发酵培养基重悬，备用。
32.（2）平菇-反硝化光合菌-小球藻共生体系处理水产养殖尾水：将制备好的平菇-反硝化光合菌-小球藻共生体系材料以1g:10l尾水的比例投入集污池，在自然日夜交替光照下，28℃处理周期7 d，处理8个不同批次样品，数据如表1、2、3所示。
33.表1投加平菇-反硝化光合菌-小球藻共生体系对水产养殖尾水处理的效果表2 水产养殖尾水8个样品主要污染指标浓度表3平菇-反硝化光合菌-小球藻共生体系处理水产养殖尾水8个样品的结果
实施例2（1）平菇-反硝化光合菌-小球藻共生体系制备：取一小环保藏的斜面固氮红细菌菌苔在光合细菌固体种子培养基上划线获得单菌落，挑取单菌落接种光合细菌液体种子培养基，200 r/min、30℃活化培养至od
600
大于1，取活化好的菌种以2%（v/v）接种光合细菌发酵培养基，在30℃、200 r/min培养60 h，吸光度od
600
达到5，培养基活菌数达到3
×
10
9 cfu/ml。
34.取5个直径0.5 cm的带有pda固体培养基的粗毛纤孔菌菌苔接种菌丝球成球培养基，在30℃条件下、150 r/min避光培养7 d，使菌丝球直径达到2 mm，干重达到8.6 g/l。
35.将白平菇菌丝球培养液与固氮红细菌培养液按1：20比例（v/v）混合，在30℃、150 r/min共培养24 h，使吸附量为3
×
10
10 cfu（细菌）/g（菌丝球）。
36.将藻种接种光合细菌发酵培养基，在30℃、150 r/min培养144 h，使吸光度od
600
大于2。
37.将平菇-反硝化光合菌共生体系与小球藻培养液按3：5比例（v/v）混合，在30℃、170 r/min共培养36 h使吸附量≥10
6 个（小球藻）/g（菌丝球），获得平菇-反硝化光合菌-小球藻共生体系；平菇-反硝化光合菌-小球藻共生体系构建结束后，室温静置24 h，纱布过滤去除上清，收集到的菌体材料用收集时原菌液体积1/7的无菌的新鲜光合细菌发酵培养基重悬，备用。
38.（2）平菇-反硝化光合菌-小球藻共生体系处理水产养殖尾水：将制备好的光合细菌自固定化细胞材料以1g:4l尾水的比例投入集污池，在自然日夜交替光照下，处理周期6 d，处理8个样品，处理结果如表4、5、6所示。
39.表4不同菌剂投加方式下水产养殖尾水处理对比
表5 水产养殖尾水8个样品中主要污染指标浓度表6平菇-反硝化光合菌-小球藻共生体系处理水产养殖尾水8个样品的结果