表达FcγRIIIa和NFAT-Luc报告基因的Jurkat细胞的构建方法及应用与流程

文档序号:34024952发布日期:2023-05-05 08:36阅读:661来源:国知局
表达FcγRIIIa和NFAT-Luc报告基因的Jurkat细胞的构建方法及应用与流程

本发明专利涉及一种表达fcγriiia和nfat-luc报告基因的jurkat细胞的构建方法、构建的细胞及应用,属于生物。


背景技术:

1、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity, adcc)是免疫系统对抗病毒感染及肿瘤疾病的一种重要免疫防御机制,是指表达fc受体的免疫细胞通过识别抗体的fc段直接杀伤与抗体特异性结合的靶细胞的作用。抗体通过与靶细胞表面抗原特异性结合,招募如自然杀伤(natural killer, nk)细胞等效应细胞杀死靶细胞。nk细胞表面表达fcγriiia蛋白,是一种抗体fc区域的受体,能识别并结合抗体的fc端,从而使nk细胞结合到靶细胞周围。一旦fc受体与抗体的fc区域结合,nk细胞就会释放细胞因子和细胞毒性颗粒,进入靶细胞触发细胞凋亡。传统的adcc检测方法是利用外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells, pbmc)或自然杀伤(nk )细胞亚群作为效应细胞进行检测,该方法的效应细胞难于制备,操作繁琐,且应答变异性很大,并容易引起很高的背景读数。

2、鉴于此,为了解决目前本领域面临的上述问题,基于adcc这一机制,本发明构建了工程化jurkat 细胞作为效应细胞用于adcc效应的检测,可用来检测、评定抗体或靶细胞的功效。本发明构建的jurkat 细胞株能够稳定表达fcγriiia(高亲和v158)受体和由 nfat应答元件驱动表达的萤火虫萤光素酶。 抗体在 adcc 作用机制中的生物活性通过 nfat通路活化产生的萤光素酶进行定量,效应细胞中的萤光素酶活性通过生物发光读数定量,检测的信号值高,且背景很低。本发明能够满足adcc实验要求,检测结果稳定,准确度高,实验程序操作简便,对于单克隆抗体产品的批次放行和稳定性检测具有很好的应用价值。


技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种可用于adcc效应检测的jurkat细胞株。

2、本发明提供了一种表达fcγriiia和nfat-luc报告基因的jurkat细胞的构建方法,包括如下步骤:

3、(1) 构建nfat-luc的慢病毒表达质粒载体,以及fcγriiia 的慢病毒表达质粒载体,其中fcγriiia基因序列如seq id no.2所示;

4、(2) 将步骤(1)中所述的两种慢病毒表达质粒载体配合慢病毒包装质粒分别转染至293v细胞中,获得携带有fcγriiia或nfat-luc的病毒颗粒;

5、(3) 用携带fcγriiia的病毒颗粒感染jurkat细胞;

6、(4) 对流式细胞仪筛选得到的阳性细胞株进行博来霉素加压筛选;

7、(5)用携带nfat-luc的病毒颗粒感染步骤(4)筛选出的jurkat细胞;

8、(6)对流式细胞仪筛选得到的阳性细胞株进行嘌呤霉素加压筛选;

9、(7) 加压筛选后的细胞进行单克隆化,筛选出单克隆阳性细胞株。

10、优选的,步骤(2)中慢病毒包装质粒为pspax2和pmd2.g,慢病毒表达质粒载体:pspax2:pmd2.g的质量比为1:1:1。

11、优选的,步骤(2)中所述转染的方式为化学转染法,所用转染试剂为阳离子聚合物pei,具体包括如下步骤;

12、(1)转染前一天按5e6 cells进行10 cm dish铺板,培养基为含10% fbs dmem,接种细胞24 h后,293v细胞的汇合度为75%-85%;

13、(2)转染前4小时,将细胞培养基换为5 ml的无血清dmem;

14、(3)将10 μg质粒dna 与0.5 ml dmem混匀后,加入20 μl pei(pei:dna=2:1)转染试剂,涡旋混匀10 秒,室温静置15 min,形成dna-pei 复合物;

15、(4)将转染复合物加入到无血清培养基细胞中,轻轻混匀,于37℃,5% co2培养箱中培养;

16、(5)转染结束4 h后换成10 ml含10% fbs dmem继续培养;

17、(6)转染48 h后收获病毒上清,离心条件为4℃,3000 g,30 min。

18、优选的,步骤(3)或(5)具体为:

19、(1)收集jurkat细胞,1000 rpm,5 min离心后,加入1-2 ml完全培养基重悬细胞,计数,用完全培养基调整至2e6 cells/ml的细胞工作液,并加入polybrene,使其终浓度为30 μg/ml;

20、(2)取100 μl的jurkat细胞工作液加入24孔板中,加入200 μl携带有fcγriiia或nfat-luc的病毒上清,混匀后置于37℃,5% co2培养箱中孵育2-3 h后,补充完全培养基至2ml;

21、(3)将24孔板放入37℃、5% co2培养箱中继续培养72 h。

22、优选的,步骤(4)中博来霉素和步骤(6)中嘌呤霉素的浓度分别为250 μg/ml、0.3μg/ml。

23、上述的表达fcγriiia和nfat-luc报告基因的jurkat细胞的构建方法获得的表达fcγriiia和nfat-luc报告基因的jurkat细胞。

24、本发明还公开了上述的表达fcγriiia和nfat-luc报告基因的jurkat细胞在检测adcc效应中的应用。

25、优选的,其步骤包括:

26、(1)将抗cd20单克隆抗体样品预稀释到3 μg/ml初始工作浓度,再进行等比例稀释;

27、(2)将步骤(2)中稀释后的抗cd20单克隆抗体样品加入到一定比例的效应细胞和靶细胞中,于37℃,5% co2培养箱加湿孵育,所述效应细胞为表达fcγriiia和nfat-luc报告基因的jurkat细胞,所述靶细胞为raji细胞;

28、(3)加入荧光底物,室温孵育5 min后,酶标仪进行读数。

29、本发明还公开了一种fcγriiia受体,其氨基酸序列如seq id no:1所示。

30、本发明还公开了一种fcγriiia受体的编码基因,其编码基因序列如seq id no:2所示。

31、本发明构建了稳定表达fcγriiia(cd16a)受体和由 nfat 应答元件驱动表达的萤火虫萤光素酶的效应细胞jurkat/ nfat/fcγriiia,将raji细胞作为靶细胞,抗体的fab段识别靶细胞上的靶抗原表位 (cd20),同时,抗体的fc段与效应细胞上的cd16a结合,导致adcc作用机制被激活,转录因子nfat启动荧光素酶报告基因的表达,加入荧光底物后产生化学发光,根据荧光素酶的表达量与抗体的浓度拟合剂量效应曲线,得到半数有效浓度ec50值,进而得到抗体药物的 adcc生物学活性。

32、抗体在 adcc 作用机制中的生物活性通过 nfat 通路活化产生的萤光素酶进行定量,效应细胞中的萤光素酶活性通过生物发光读数定量,检测的信号值高,且背景很低。本发明能够满足adcc实验要求,检测结果稳定,准确度高,实验程序操作简便,对于单克隆抗体产品的批次放行和稳定性检测具有很好的应用价值。

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