表达FcγRIIIa和NFAT-Luc报告基因的Jurkat细胞的构建方法及应用与流程

本发明专利涉及一种表达fcγriiia和nfat-luc报告基因的jurkat细胞的构建方法、构建的细胞及应用，属于生物。

背景技术：

1、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity, adcc）是免疫系统对抗病毒感染及肿瘤疾病的一种重要免疫防御机制，是指表达fc受体的免疫细胞通过识别抗体的fc段直接杀伤与抗体特异性结合的靶细胞的作用。抗体通过与靶细胞表面抗原特异性结合，招募如自然杀伤（natural killer, nk）细胞等效应细胞杀死靶细胞。nk细胞表面表达fcγriiia蛋白，是一种抗体fc区域的受体，能识别并结合抗体的fc端，从而使nk细胞结合到靶细胞周围。一旦fc受体与抗体的fc区域结合，nk细胞就会释放细胞因子和细胞毒性颗粒，进入靶细胞触发细胞凋亡。传统的adcc检测方法是利用外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells, pbmc）或自然杀伤（nk ）细胞亚群作为效应细胞进行检测，该方法的效应细胞难于制备，操作繁琐，且应答变异性很大，并容易引起很高的背景读数。

2、鉴于此，为了解决目前本领域面临的上述问题，基于adcc这一机制，本发明构建了工程化jurkat 细胞作为效应细胞用于adcc效应的检测，可用来检测、评定抗体或靶细胞的功效。本发明构建的jurkat 细胞株能够稳定表达fcγriiia（高亲和v158）受体和由 nfat应答元件驱动表达的萤火虫萤光素酶。 抗体在 adcc 作用机制中的生物活性通过 nfat通路活化产生的萤光素酶进行定量，效应细胞中的萤光素酶活性通过生物发光读数定量，检测的信号值高，且背景很低。本发明能够满足adcc实验要求，检测结果稳定，准确度高，实验程序操作简便，对于单克隆抗体产品的批次放行和稳定性检测具有很好的应用价值。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种可用于adcc效应检测的jurkat细胞株。

2、本发明提供了一种表达fcγriiia和nfat-luc报告基因的jurkat细胞的构建方法，包括如下步骤：

3、(1) 构建nfat-luc的慢病毒表达质粒载体，以及fcγriiia 的慢病毒表达质粒载体，其中fcγriiia基因序列如seq id no.2所示；

4、(2) 将步骤(1)中所述的两种慢病毒表达质粒载体配合慢病毒包装质粒分别转染至293v细胞中，获得携带有fcγriiia或nfat-luc的病毒颗粒；

5、(3) 用携带fcγriiia的病毒颗粒感染jurkat细胞；

6、(4) 对流式细胞仪筛选得到的阳性细胞株进行博来霉素加压筛选；

7、(5)用携带nfat-luc的病毒颗粒感染步骤（4）筛选出的jurkat细胞；

8、(6)对流式细胞仪筛选得到的阳性细胞株进行嘌呤霉素加压筛选；

9、(7) 加压筛选后的细胞进行单克隆化，筛选出单克隆阳性细胞株。

10、优选的，步骤（2）中慢病毒包装质粒为pspax2和pmd2.g，慢病毒表达质粒载体：pspax2：pmd2.g的质量比为1:1:1。

11、优选的，步骤(2)中所述转染的方式为化学转染法，所用转染试剂为阳离子聚合物pei，具体包括如下步骤；

12、(1)转染前一天按5e6 cells进行10 cm dish铺板，培养基为含10% fbs dmem，接种细胞24 h后，293v细胞的汇合度为75%-85%；

13、(2)转染前4小时，将细胞培养基换为5 ml的无血清dmem；

14、(3)将10 μg质粒dna 与0.5 ml dmem混匀后，加入20 μl pei（pei:dna=2:1）转染试剂，涡旋混匀10 秒，室温静置15 min，形成dna-pei 复合物；

15、(4)将转染复合物加入到无血清培养基细胞中，轻轻混匀，于37℃，5% co2培养箱中培养；

16、(5)转染结束4 h后换成10 ml含10% fbs dmem继续培养；

17、(6)转染48 h后收获病毒上清，离心条件为4℃，3000 g，30 min。

18、优选的，步骤（3）或（5）具体为：

19、（1）收集jurkat细胞，1000 rpm，5 min离心后，加入1-2 ml完全培养基重悬细胞，计数，用完全培养基调整至2e6 cells/ml的细胞工作液，并加入polybrene，使其终浓度为30 μg/ml；

20、（2）取100 μl的jurkat细胞工作液加入24孔板中，加入200 μl携带有fcγriiia或nfat-luc的病毒上清，混匀后置于37℃，5% co2培养箱中孵育2-3 h后，补充完全培养基至2ml；

21、（3）将24孔板放入37℃、5% co2培养箱中继续培养72 h。

22、优选的，步骤(4)中博来霉素和步骤（6）中嘌呤霉素的浓度分别为250 μg/ml、0.3μg/ml。

23、上述的表达fcγriiia和nfat-luc报告基因的jurkat细胞的构建方法获得的表达fcγriiia和nfat-luc报告基因的jurkat细胞。

24、本发明还公开了上述的表达fcγriiia和nfat-luc报告基因的jurkat细胞在检测adcc效应中的应用。

25、优选的，其步骤包括：

26、（1）将抗cd20单克隆抗体样品预稀释到3 μg/ml初始工作浓度，再进行等比例稀释；

27、（2）将步骤(2)中稀释后的抗cd20单克隆抗体样品加入到一定比例的效应细胞和靶细胞中，于37℃，5% co2培养箱加湿孵育，所述效应细胞为表达fcγriiia和nfat-luc报告基因的jurkat细胞，所述靶细胞为raji细胞；

28、（3）加入荧光底物，室温孵育5 min后，酶标仪进行读数。

29、本发明还公开了一种fcγriiia受体，其氨基酸序列如seq id no：1所示。

30、本发明还公开了一种fcγriiia受体的编码基因，其编码基因序列如seq id no：2所示。

31、本发明构建了稳定表达fcγriiia（cd16a）受体和由 nfat 应答元件驱动表达的萤火虫萤光素酶的效应细胞jurkat/ nfat/fcγriiia，将raji细胞作为靶细胞，抗体的fab段识别靶细胞上的靶抗原表位 (cd20)，同时，抗体的fc段与效应细胞上的cd16a结合，导致adcc作用机制被激活，转录因子nfat启动荧光素酶报告基因的表达，加入荧光底物后产生化学发光，根据荧光素酶的表达量与抗体的浓度拟合剂量效应曲线，得到半数有效浓度ec50值，进而得到抗体药物的 adcc生物学活性。

32、抗体在 adcc 作用机制中的生物活性通过 nfat 通路活化产生的萤光素酶进行定量，效应细胞中的萤光素酶活性通过生物发光读数定量，检测的信号值高，且背景很低。本发明能够满足adcc实验要求，检测结果稳定，准确度高，实验程序操作简便，对于单克隆抗体产品的批次放行和稳定性检测具有很好的应用价值。