一种猴痘病毒mRNA疫苗及其制备方法与用途

本发明属于生物医药，具体涉及一种猴痘病毒mrna疫苗其制备方法与用途。

背景技术：

1、自2022年5月初以来，已有多个国家向世卫组织报告了猴痘病例，据世卫组织统计，截止到2022年10月24日，全球已在109个国家发现了7.5万多感染病例。2022年7月27日，世界卫生组织正式宣布猴痘疫情进入全球卫生紧急状态。

2、引起猴痘的病原体是猴痘病毒(mpxv)，该病毒属于痘病毒科正痘病毒(opxv)属的成员。该病毒的成员主要包括天花病毒(varv)、痘苗(天花疫苗)病毒(vacv)、牛痘病毒(cpxv)、mpxv等10多个种。mpxv基因组为双链dna，长约197kb。该病毒包含约190个开放阅读框，其中4个位于末端反向重复序列中。与天花病毒一样，mpxv可以广泛感染哺乳动物，包括啮齿类动物和人均是其宿主，mpxv根据其亚型(刚果毒株和西非毒株亚型)不同导致的人类病死率约分别为10.6％和3.6％。

3、mpxv有两种病毒形式，即成熟病毒粒子(mature virion，mv)和包膜病毒粒子(extracellμlar enveloped，ev)，这两种病毒粒子分别由包含20多种蛋白质的膜包裹而成，有些病毒粒子还包含由8种独特蛋白质组成的第二外膜。目前，有研究已在mpxv发现了9个病毒中和靶点，分别为7个mv蛋白(a13、a17、a27、a28、d8、h3、l1)和2个ev特异性蛋白(a33和b5)，这些蛋白统一使用痘苗病毒蛋白命名系统命名。

4、猴痘目前无特异的治疗方法，只能根据患者的临床状况进行一些对症处理。为了有效防控猴痘疫情的蔓延，疫苗开发势在必行。由于正痘病毒属成员间的基因组的高度相似性，天花疫苗(来源于痘苗病毒的减毒活疫苗)可对人类猴痘提供85％的保护。但是这类疫苗仍然存在许多缺点：(1)制备工艺复杂，需要用细胞培养的方法生产活病毒，存在一定的安全隐患；(2)质量控制和工艺放大要求高：(3)属于活病毒型疫苗，存在可能的因接种疫苗导致人际传播，且不良反应较大；(4)未采用猴痘特异有效抗原，有效保护率不能达到最高。因此，提供一种针对猴痘的改进疫苗显得尤为重要。

技术实现思路

1、为了克服上述现有技术的不足，本发明基于猴痘特异有效抗原，制备了用于猴痘疫情的核酸疫苗，该核酸疫苗可以编码具有较强免疫原性的a13，和/或a17，和/或a27、和/或a28、和/或a33、和/或b5、和/或d8、和/或h3，和/或l1蛋白，只需要低剂量即可有效激活机体的体液免疫，使针对猴痘的igg达到高峰分泌量，起到预防或杀伤猴痘病毒的效果。

2、本发明是通过以下技术方案来实现的：

3、本发明第一方面提供了一种编码猴痘病毒抗原的核酸分子，所述核酸分子至少包括一个编码猴痘病毒a13、a17、a27、a28、a33、b5、d8、h3和l1蛋白(基于痘苗病毒命名系统)的核苷酸。

4、所述核酸分子包含5’-帽结构、5’-utr、3’-聚核苷酸序列以及3’-utr中的至少一种。其中，5’-utr为10-200个核苷酸，优选的50-100个核苷酸；3’-utr为50-120个核苷酸；3’-聚核苷酸序列为100-120个a，进一步优选为110-120个a。

5、优选地，所述核酸分子包括seq id no：27所示的mrna、seq id no：28所示的mrna、seq id no：29所示的mrna、seq id no：30所示的mrna、seq id no：31所示的mrna、seq idno：32所示的mrna、seq id no：33所示的mrna、seq id no：34所示的mrna、seq id no：35所示的mrna、seq id no：36所示的mrna、seq id no：37所示的mrna中的至少一种。

6、本发明第二方面提供了一种核酸-脂质体复合物，所述核酸-脂质体复合物包括第一方面所述的核酸分子，以及将核酸分子包封在脂质壳中的阳离子脂质纳米颗粒，所述阳离子脂质纳米颗粒包括可质子化的阳离子脂质、结构脂质、辅助脂质和聚乙二醇化脂质。

7、优选地，所述阳离子脂质纳米颗粒与核酸分子的质量比为1：1-50：1。

8、优选地，按摩尔百分比计，所述阳离子脂质纳米颗粒包括15-49％可质子化的阳离子脂质、40-50％结构脂质、5-20％辅助脂质和1-5％聚乙二醇化脂质。

9、优选地，所述结构脂质包括胆固醇及其衍生物，所述辅助脂质包括dspc、dope、dopg、dops，所述聚乙二醇化脂质包括peg-dmg、peg-dspe。更优选地，所述结构脂质为胆固醇，所述辅助脂质为dspc，所述聚乙二醇化脂质为peg-dmg。

10、本发明第三方面提供了第二方面所述的核酸-脂质体复合物的制备方法，包括以下步骤：

11、s1、将可质子化的阳离子脂质、结构脂质、辅助脂质和聚乙二醇化脂质溶于有机溶剂中，得到有机相；

12、s2、将核酸分子溶于缓冲液中，得到水相；

13、s3、将有机相和水相充分混匀后得到混合液，替换混合液中的溶媒缓冲液及有机相中的溶剂后得到核酸-脂质体复合物。

14、优选地，所述有机溶剂包括但不限于乙醇，所述缓冲液包括但不限于柠檬酸盐缓冲液、醋酸钠溶液。

15、本发明第四方面提供了第一方面所述的核酸分子，和/或第二方面所述的核酸-脂质体复合物在制备防治猴痘的药物中的应用。

16、优选地，防治猴痘的药物包括预防猴痘的疫苗。

17、本发明利用第一方面公开的mrna开发了一种疫苗，以mrna作为疫苗的主要成分具有研发快速、安全性高、易产业化等优点；以mrna作为疫苗的主要成分制备工艺简单，无需使用细胞增殖病毒或生产重组蛋白；使用极小剂量即能达到足够的保护效果，在安全性、有效性方面优于现有的减毒活疫苗或重组蛋白疫苗技术。

18、更优选地，疫苗的给药方式包括雾化给药、静脉注射、皮下注射、肌肉注射、眼部给药。

19、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

20、本发明公开了一种能够对猴痘病毒进行高效预防的编码猴痘病毒一个或多个特异抗原靶点的核酸分子，该核酸分子至少包括一个编码猴痘病毒a13、a17、a27、a28、a33、b5、d8、h3和l1蛋白的核苷酸，或者上述核苷酸的脂质纳米颗粒。该核酸分子或其脂质纳米颗粒递具有良好的免疫原性，能在短时间内诱导机体产生强烈的细胞及体液免疫反应，将该核酸分子或其脂质纳米颗粒递送至体内后能够在机体内表达a13，和/或a17，和/或a27，和/或a28，和/或a33，和/或b5，和/或d8，和/或h3，和/或l1蛋白，触发机体的免疫反应，能够使机体产生抗体应对猴痘病毒。同时，该核酸分子或其脂质纳米颗粒只需要低剂量即可有效激活机体的体液免疫，使针对猴痘的igg达到高峰分泌量，起到较好的预防或杀伤猴痘病毒的效果。此外，该核酸分子或其脂质纳米颗粒制备快速简便，可在短期内实现大规模生产，有利于用于应对突发的猴痘疫情。