一种用于细胞三维培养的超疏水孔板，多器官微流控芯片及其应用

本发明涉及细胞三维培养和器官芯片，具体涉及一种用于细胞三维培养的超疏水孔板，多器官微流控芯片及其应用。

背景技术：

1、细胞三维培养比传统的二维贴壁培养更仿生，已日渐成为生物学研究中细胞培养的主流模式。细胞三维培养可以分为无支架三维培养和有支架三维培养两大类。其中无支架培养方式对于细胞的操控更为灵活。而无支架三维培养又依赖于hanging dropmicroplate,micropatterned surface microplate和ultra-low adhesion microplate(低粘附孔板)三种模式，其中低粘附孔板是使用较普遍和方便的。

2、传统低粘附孔板的原理是在孔的表面修饰化学涂层。这一层化学涂层可以阻碍细胞粘附在孔底，从而可以使细胞悬浮在培养液中自发聚团生长，形成三维的细胞球、原代组织块或者类器官。但传统低粘附孔板的问题在于，原始的细胞、原代组织或者最终聚合的细胞球和类器官会不停的向培养液中分泌细胞外基质和蛋白，化学涂层对这些细胞外基质和蛋白是不抗拒的，这些细胞外基质和蛋白便会沉降并粘附在化学涂层上，使化学涂层失效，从而细胞、原代组织块或者生成的细胞球和类器官便会贴附在孔底、从而影响到三维培养。

3、传统低粘附孔板的上述问题导致了三个后果：第一，它并不普适于所有细胞的三维培养，特别是那些细胞外基质和蛋白分泌旺盛的细胞(譬如肾细胞、神经细胞)；第二，对于大多数普通的细胞，传统低粘附孔板一般也很难实现长时间三维培养；第三，传统低粘附孔板一般很难多次使用。此外，传统的低粘附孔板中孔的尺寸、形状、大小是固定的，很难随具体实验的需求而调整；而且，它不能和微流控芯片等下游分析平台集成，实现自动化的细胞分析。

4、上述缺点限制了传统低粘附孔板的应用范围和潜力。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是提供一种用于细胞三维培养的超疏水低粘附孔板，该超疏水低粘附孔板解决了传统低粘附孔板的上述问题。

2、为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

3、本发明提供了一种用于细胞三维培养的超疏水孔板，所述超疏水孔板具有一个或多个培养孔，所述培养孔的底面为具有微纳米形貌的超疏水表面，其与水相溶液的接触角大于120°；所述培养孔的侧面为疏水表面或者超疏水表面，其与水相溶液的接触角大于90°。

4、本发明中，利用具有自清洁功能的微纳米超疏水表面，制造低粘附孔板。将水相溶液(如细胞培养液)注入含有超疏水微纳米结构的培养孔后，溶液不能完全覆盖超疏水底面，仅能部分接触甚至不接触，从而以一种半悬空甚至悬空的状态存在，因此，减少了细胞和培养孔底面的接触面积。另外，由于这种微纳米超疏水表面并不粘附细胞外基质和蛋白，因此沉积在上面的这些物质(譬如蛋白，细胞外基质等)很容易清洗掉，从而可以实现超疏水孔板的反复使用和长期使用。

5、进一步地，制作所述超疏水孔板的材料既可以为高分子聚合物材料，例如聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚二甲基硅氧烷(pdms)、聚苯乙烯(ps)、聚碳酸酯(pc)等；也可以为金属、陶瓷、玻璃、石英、硅等材料；或者上述一种或多种材料的组合。

6、本发明中，对于超疏水孔板上培养孔的数目不限，例如可以为1-2000个。对于培养孔的底面形状和平整度也不做限制，例如可以为圆形、正方形、长方形、三角形或者其他不规则形状，也可以为凹凸不平的形状。同样的，对于培养孔的大小和深度也不做限制，可根据需要进行设置。例如，培养孔的深度可以为0.5-20cm，直径可以为0.5-20cm。

7、本发明中，制作所述超疏水孔板的方法包括方法一和方法二：

8、所述方法一包括以下步骤：

9、s1.制备超疏水底板；

10、s2.制备带通孔的疏水板；

11、s3.将上述超疏水底板和疏水板贴合封接在一起，即得到所述用于细胞三维培养的超疏水孔板；

12、所述方法二包括以下步骤：

13、s4.在板材上通过一次成型得到培养孔；

14、s5.对上述培养孔的内表面进行超疏水修饰，即得到所述用于细胞三维培养的超疏水孔板；

15、其中，形成超疏水表面的方法包括表面刻蚀、mems加工、表面富集二氧化硅微纳米颗粒、表面喷射超疏水涂料和二次翻模。

16、在一种实施方式中，表面富集二氧化硅微纳米颗粒的方法为：

17、将纳米二氧化硅颗粒、正己烷和氯仿混合后进行超声处理，使纳米二氧化硅颗粒分散于混合溶液中；接着，将pmma板材浸入所述混合溶液中，取出晾干，即得到了具有微纳米结构的超疏水表面。

18、优选地，上述表面富集二氧化硅微纳米颗粒的方法具体为：称取0.25-2g直径为2-200nm的疏水性纳米二氧化硅颗粒，量取20-500ml正己烷和0.5-50ml氯仿。将上述材料混合后进行超声处理，使纳米二氧化硅颗粒完全分散在混合溶液中。将pmma板材浸入上述溶液中约5-300秒，取出晾干，便得到了具有表面超疏水微纳米结构的pmma表面。

19、在另一种实施方式中，表面刻蚀的方法为：

20、将pdms板材浸入原硅酸四乙酯中使其溶胀，然后取出溶胀的pdms板材，置于乙二胺水溶液中；接着取出pdms板材，冲洗后进行热处理，即得到具有微纳米结构的超疏水表面。

21、优选地，上述表面富集二氧化硅微纳米颗粒的方法具体为：将pdms板材浸入30-70℃的原硅酸四乙酯中10-200分钟，然后，将溶胀的pdms板材从原硅酸四乙酯溶液中取出，立即漂浮在5％-40％的乙二胺水溶液中。3-24小时后，取出并用去离子水冲洗3-5次，烘箱中热处理0.5-5小时，得到具有表面超疏水微纳米结构的pdms板材。

22、进一步地，所述二次翻模的方法为：

23、a.将弹性树脂的预聚液(譬如pdms预聚液)浇注在具有表面超疏水微纳米结构的模板上，使弹性树脂预聚液聚合成第一弹性固体，再将第一弹性固体从模板上剥离；

24、b.对第一弹性固体的表面进行硅烷化修饰，并以硅烷化修饰的第一弹性固体为模板，再浇注弹性树脂的预聚液，使弹性树脂预聚液聚合成第二弹性固体；

25、c.将第二弹性固体从硅烷化修饰的第一弹性固体模板上剥离，此时，第二弹性固体的表面便形成了表面超疏水微纳米结构。

26、进一步地，所述具有表面超疏水微纳米结构的模板为天然材料(譬如蝉翼、荷叶等)或通过人工方法制备，所述人工方法包括表面刻蚀、mems加工、表面富集二氧化硅微纳米颗粒、表面喷射超疏水涂料。

27、本发明提供的上述超疏水孔板，水相溶液注入培养孔后，溶液不能完全覆盖超疏水底面，仅能部分接触甚至不接触，从而以一种半悬空甚至悬空的状态存在。超疏水底面是自清洁的，对蛋白，核酸，细胞等的吸附率极低，且表面并不粘附细胞外基质和蛋白，可以有效的防止了细胞的爬出。因此，该超疏水孔板既可以用于细胞球、原代组织块、类器官等细胞的三维培养，也可以用于血细胞、免疫细胞等悬浮细胞的培养。此外，其还可以用于药物成药性评价，包括药效，药代和毒性。

28、进一步地，本发明还提供了一种多器官微流控芯片，包括所述的超疏水低粘附孔板、多孔膜和上层基板；所述上层基板盖合于所述超疏水孔板上，所述多孔膜位于所述超疏水孔板与上层基板之间；所述上层基板上设置有微通道，所述微通道通过所述多孔膜与超疏水孔板上的培养孔连通，且所述上层基板上设有与所述微通道连通的进口与出口；

29、所述培养孔中用于培养悬浮细胞、细胞球、原代组织块或者类器官，所述微通道中用于添加药物或者外源性刺激物；微通道中的药物或者外源性刺激物可通过所述多孔膜进入到下方的培养孔中。

30、本发明中，所述上层基板的材质可以为高分子聚合物(聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷、聚苯乙烯、聚碳酸酯等)、金属、陶瓷、玻璃、石英、硅等材料，且其可以采用与低粘附孔板相同或不同的材质。多孔膜的材质包括聚碳酸酯、聚二甲基硅氧烷、聚乙烯膜、pes(聚醚砜)、纤维素及其衍生物、聚氯乙烯、聚偏氟乙烯pvdf、聚砜、聚丙烯腈、聚酰胺、聚砜酰胺、磺化聚砜、交链的聚乙烯醇、改性丙烯酸聚合物、聚四氟乙烯(ptfe)多孔薄膜、多孔聚氨酯薄膜、中空纤维超滤膜、quantifoil铜网多孔膜，quantifoil二氧化硅支持膜，quantifoil碳膜、多孔氧化铝膜或无机陶瓷膜。

31、进一步地，多孔膜上可以培养有血管内皮细胞和/或免疫细胞。

32、本发明中，培养孔孔顶和微通道连结，因此培养孔内的培养液可以通过微通道中流动的培养液进行实时更新，从而实现微型组织的长期培养，而且多个孔内不同的组织，可以通过上方微通道进行实时通讯，从而为多器官芯片的构建奠定了基础。另外，可以使用微型组织来构建多器官芯片，可以大幅增加多器官芯片集成器官的数目。

33、进一步地，所述培养孔的底板或者侧壁上开设有贯穿孔，所述贯穿孔用于将微型搅拌桨或传感器伸入到培养孔中，从而可以对培养孔中的培养液进行搅拌或对培养液的一些参数进行检测，也可以向培养孔中的培养液输送氧气，从而维持组织的活力。该贯穿孔的孔径优选地在0.5mm-4mm之间。

34、本发明的多器官微流控芯片中，微通道内的液体通过多孔膜与培养孔内的液体连通，微通道内流通的药物或者外源性刺激物可以穿过多孔膜与孔内的微型组织、悬浮细胞、类器官或者细胞球相互作用，从而可以评价该药物的成药性，包括药效，药代和毒性评价。因此本发明还提供了所述的一种多器官微流控芯片在药物成药性评价中的应用。

35、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

36、1.本发明的超疏水孔板，将水相溶液注入含有超疏水微纳米结构的培养孔后，溶液不能完全覆盖超疏水底面，仅能部分接触甚至不接触，从而以一种半悬空甚至悬空的状态存在，因此，减少了细胞和孔底面的接触面积，从而降低了细胞在底面贴壁的概率。

37、2.本发明的超疏水孔板，微纳米超疏水表面并不粘附细胞外基质和蛋白，因此沉积在上面的这些物质很容易清洗掉，从而可以实现孔板的反复使用和长期使用。

38、3.本发明中，微纳米超疏水表面可以在多种材质上实现，譬如玻璃，高聚物，陶瓷等等，其中就包括可以用来加工微流控芯片的材质，因此利用微纳米超疏水表面可以把低粘附的孔和微流控芯片集成起来，构建一体化的细胞分析和药物筛选新平台。