一种快速筛选抗灰霉病月季种质资源的方法

1.本发明属木本花卉抗病育种技术领域，具体涉及不同月季种质资源对灰霉病的抗性鉴定和筛选。


背景技术：

2.月季(rosa hybrida)是蔷薇科(rosaceae)蔷薇属(rosa)植物，深受消费者的青睐，是全球第一大切花。云南省是全球月季切花的主产区之一。
3.月季灰霉病是由灰葡萄孢(botrytis cinerea)引起的一种真菌病害，是切花月季采后运输过程中最为严重的真菌病害。该病害对花朵的危害最为严重，该病害的爆发，让生产商和经销商所受直接经济损失高达70％以上。目前，生产中主要通过反复施用化学药剂来预防和控制月季灰霉病的发生，这样不仅增加了生产成本，还造成了对环境的污染和破坏，同时还严重降低了其观赏价值。因此，选育和种植抗灰霉病月季新品种是今后绿色生产的关键。
4.选育月季抗灰霉病新品种的前提，就是要应用准确高效的抗病鉴定和筛选方法，对大量的月季亲本材料和大量的月季杂交后代，进行抗灰霉病鉴定和筛选工作，以期缩短抗灰霉病育种的周期。迄今为止，国内外尚未有利用分子标记技术筛选抗灰霉病月季种质资源的研究报道。目前，国内外对于抗灰霉病植物的传统筛选鉴定方法主要是：将灰霉菌接种到鉴别寄主植物上，经过一定的真菌孢子繁殖周期，记录和统计寄主植物感病面积的变化情况，以此鉴别出不同抗灰霉病等级的植物材料。
5.基于我们前期对月季灰霉菌对月季资源各个阶段的危害特点、月季抗灰霉病基因的克隆和测序、月季抗灰霉病基因分子标记开发等多方面开展了大量的科研工作，发现结合现代分子生物技术对抗病材料进行鉴定筛选，不仅能准确地鉴定和筛选出抗病材料，而且能缩短鉴定周期，同时还具有操作方便、省工省材等优点。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种能够快速筛选抗灰霉病的月季种质资源的方法，以便解决目前抗灰霉病植物的传统筛选鉴定方法存在的费事费力费时和容易鉴别不精准的缺陷。
7.本文所使用的术语：
8.荧光定量rtfq-pcr技术：实时荧光定量聚合酶链反应，英文real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，简称：rtfq-pcr。
9.ubc基因：泛素结合蛋白(ubiquitin conjugating protein)基因。
10.rcwrky22基因：月季七肽(wrkygqk)保守转录因子基因(rosa chinensis probable wrky transcription factor 40locus chromosome 2，rcwrky22)
11.本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
12.本发明提供一种利用荧光定量rtfq-pcr技术快速筛选抗灰霉病月季种质资源的
专用引物rcwrky22，所述专用引物rcwrky22由rcwrky22上游引物和rcwrky22下游引物组成，所述rcwrky22上游引物的核苷酸序列如seq idno：1所示，rcwrky22下游引物的核苷酸序列如seq id no：2所示。
13.本发明还提供一种利用荧光定量rtfq-pcr技术快速筛选抗灰霉病月季种质资源的方法，包括将采集的待鉴定月季种质资源材料花瓣样本和对照月季种质资源材料花瓣样本分别清洗后，分别将其花瓣样本平铺在盛有培养基的培养皿中，用上述专用引物rcwrky22分别对接种了月季灰霉菌的待鉴定月季种质资源材料培养12h并清洗后的花瓣样本和培养12h的对照月季种质资源材料花瓣样本进行抗月季灰霉病标记基因相对表达量的测定，按抗月季灰霉病标记基因相对表达量划分的抗月季灰霉病等级鉴定月季种质资源材料对月季灰霉病的抗性级别。
14.进一步，在上述方法中，所述待鉴定月季种质资源材料花瓣样本和对照月季种质资源材料花瓣样本均采集待鉴定月季种质资源材料上无病虫害的花瓣。
15.进一步，在上述方法中，所采集的花瓣样本为待鉴定月季种质资源材料上花朵从内到外第1～2层的无病虫害的花瓣。
16.进一步，在上述方法中，所述按抗月季灰霉病标记基因相对表达量划分的抗月季灰霉病等级为如下4个等级：
17.0级：免疫，相对表达量≧8；
18.1级：高抗，相对表达量≧6，且《8；
19.2级：中抗，相对表达量≧4，且《6；
20.3级：低抗，相对表达量≧2，且《4。
21.进一步，在上述方法中，所述将采集的待鉴定月季种质资源材料花瓣样本和对照月季种质资源材料花瓣样本分别清洗是用70％v/v乙醇和无菌水清洗，先将采集的花瓣样本用70％v/v乙醇浸泡45-60s，然后用无菌水清洗3～5次。
22.进一步，在上述方法中，所述对接种了月季灰霉菌的待鉴定月季种质资源材料培养12h并清洗中的清洗是用无菌水冲洗其花瓣3～5次。
23.进一步，在上述方法中，所述接种采用滴液法将浓度1
×
105/ml月季灰霉菌孢子悬浮液接种到每片花瓣上。
24.进一步，在上述方法中，所述培养是在室内光强2000～3200lx、室内空气相对湿度80～90％、室温22℃～25℃的条件下培养。
25.进一步，在上述方法中，所述培养基是：ms+苯并咪唑0.4g/l+琼脂8.0g/l。
26.表1引物序列
27.28.与现有技术相比，本发明的主要创新点和有益效果是：
29.1.通过前期大量的实验，将所收集的445份月季种质资源利用本发明方法进行了抗月季灰霉病筛选试验，其结果表明，用本发明方法筛选鉴定出的抗月季灰霉病的月季种质资源与采用传统的方法鉴定结果，相比较后，结果完全一致，说明本发明方法可高效准确地在我国各地鉴定出抗灰霉病月季种质资源，而且节约成本、省工省时，尤其适用于对大量的月季资源杂交后代早期抗灰霉病鉴定和筛选，是一套适用于我国各地进行高效鉴定和筛选抗灰霉病月季种质资源的方法。
30.2.本发明方法的核心是利用我们前期研发的月季抗灰霉病标记基因专用引物rcwrky22，结合荧光定量rtfq-pcr技术，从而获得抗灰霉病标记基因(rcwrky22基因)在接种的不同月季种质资源花瓣中的相对表达量这一数字，最终依据相对表达量这一数字的范围大小来划分各个月季种质资源的抗灰霉病等级。
31.3.鉴定时间短。从月季灰霉病真菌接种花瓣材料到完成抗灰霉病鉴定工作小于1d，而传统方法则需要3d以上。传统鉴定方法是接种后，每天需要人工对寄主材料上的感病面积进行记录并统计，一方面费时费力，另一方面容易产生统计误差。
32.综上所述，本发明提供的这套适用于我国各地区进行抗灰霉病月季种质资源鉴定和筛选的方法及其专用引物，使在国内进行大量的月季杂交后代抗灰霉病准确快速的鉴定筛选工作成为可能；本发明方法，使得抗灰霉病月季种质资源的鉴定筛选周期缩短到小于1天，鉴定材料用量少(仅用3～5片花瓣)，实用范围广、操作简便，占用空间小，鉴定准确、筛选快速。
33.序列表中seq id no：1所示的是rcwrky22上游引物的核苷酸序列。
34.序列表中seq id no：2所示的是rcwrky22下游引物的核苷酸序列。
35.序列表中seq id no：3所示的是内参通用引物ubc上游引物的核苷酸序列。
36.序列表中seq id no：4所示的是内参通用引物ubc下游引物的核苷酸序列。
具体实施方式
37.以下实施例无特殊说明的为常规方法。实施例中所涉及的试剂、试剂盒、月季灰霉病菌、50份月季种质资源等所有材料均可从商业渠道购买。
38.实施例1我国各地收集的50份月季种质资源的抗灰霉病鉴定
39.(1)接种材料的准备：分别采集待鉴定的50份月季种质资源材料(见表1)上无病虫害的花瓣，选取植物材料花朵从内到外第1～2层的无病虫害的花瓣，依次用70％v/v乙醇和无菌水清洗，其清洗过程如下：将采集的花瓣用70％v/v乙醇浸泡1min,然后用无菌水清洗3～5次，将清洗的花瓣正面朝上平铺在盛有营养基质的培养皿中，每培养皿铺3片，所述营养基质配方：ms+苯并咪唑0.4g/l+琼脂8.0g/l。
40.(2)接种试验：选取实验室培养的月季灰霉病菌，作为接种真菌，并用已灭菌的解剖针将已培养好的月季灰霉菌挑到含有0.03％(v/v)吐温20的无菌蒸馏水中，将月季灰霉菌孢子浓度用含有0.03％(v/v)吐温20的无菌蒸馏水调至为浓度1
×
105/ml的悬浮液；而后用移液器取200μl悬浮液接种到待鉴定的花瓣上(每个培养皿接种200μl悬浮液)，每份材料接种3片，每个处理3次重复，同时，保留相应一份相同处理但不接种所述悬浮液的花瓣作为对照。接种完成后，将待鉴定材料和对照的培养皿在室内光强2000～3200lx、室内空气相对
湿度80～90％、室温22℃～25℃的条件下培养12h。月季灰霉病菌的诊断可参考文献(noack r.breeding and selection strategies for disease and pest resistance.in:encyclopedia of rose science.roberts av,debener t,gudin s eds.,oxford:elsevier academic press,2003,1:144-147)中的诊断方法对月季灰霉病菌进行诊断。
41.(3)荧光定量rtfq-pcr试验：委托上海捷瑞生物科技有限公司合成本发明提供的抗灰霉病标记基因专用引物rcwrky22和内参通用引物ubc以备用。抗灰霉病标记基因是rcwrky22(r.chinensis probable wrky transcription factor40locus chromosome 2)，在genbank上有全基因序列，登录号xm_024320209.1。内参基因是ubc(ubiquitin conjugating protein)，在genbank上有全基因序列，登录号jn399227。专用引物rcwrky22由seq id no：1所示的rcwrky22上游引物和seq id no：2所示的rcwrky22下游引物组成。内参通用引物ubc由seq id no：3所示的内参通用引物ubc上游引物和seq id no：4所示的是内参通用引物ubc下游引物组成。
42.将上述接种材料培养12h后进行清洗后(此处清洗是用无菌水冲洗所培养的花瓣3～5次，以去除接种的孢子悬浮液中的残留月季灰霉菌)的花瓣样本和培养12h的对照花瓣样本，按照北京transgen biotech公司生产的rna提取试剂盒和cdna合成试剂盒的说明书进行试验操作，将所有对照花瓣样本和所述的接种花瓣样本的cdna一一合成好后，按照北京transgen biotech公司生产的荧光定量rtfq-pcr试剂盒说明书的步骤，对接种的材料和对照进行抗灰霉病标记基因相对表达量的测定。荧光定量rtfq-pcr反应体系20μl，其中，ddh2o6μl，荧光定量混合试剂10μl，上游引物(0.25nm)1μl，下游引物(0.25nm)1μl，接种材料或对照材料cdna 2μl；反应程序：95℃预变性5min，循环内95℃变性15s，58℃退火15s；+plate read(荧光信号的采集，每个循环进行一次荧光信号的收集)，共45个循环。内参基因的荧光定量rtfq-pcr反应体系(同上)，反应程序(同上)。测定结果采用sas v9.0软件进行anova分析(方差分析)，对其抗灰霉病标记基因相对表达量的平均值和标准误差进行计算，最终数据采用相对表达量平均值
±
标准误差方式进行记录。
43.(4)抗灰霉病等级的鉴定：依据所述抗灰霉病标记基因在不同待鉴定资源花瓣中的相对表达量来划分抗灰霉病等级，分为如下4个等级：
44.0级：免疫，相对表达量≧8；
45.1级：高抗，相对表达量≧6，且《8；
46.2级：中抗，相对表达量≧4，且《6；
47.3级：低抗，相对表达量≧2，且《4；
48.当相对表达量《2时，表明该种质资源为易感灰霉病，不属于抗灰霉病资源。
49.结果详见表1。
50.表2 50份月季种质资源的抗灰霉病鉴定结果
51.52.[0053][0054]
注：表2中
“‑‑”
：表示该种质资源为易感灰霉病，不属于抗灰霉病资源；抗灰霉病基因的相对表达量数据是三次重复的平均值。