一种改性分子酶的制备方法及其分子免疫层析检测方法与流程

1.本技术涉及分子检测领域，更具体地说，它涉及一种改性分子酶的制备方法及其分子免疫层析检测方法。


背景技术：

2.分子免疫层析检测是近年来快速发展的一种快速免疫检测技术。目前检测病毒一般是通过检测试剂盒检测的，检测方法是先加入裂解液将人体或动物样本中的核酸提取出来，然后通过吸附、洗脱等纯化核酸，再往核酸中加入酶进行等温扩增后，加入试剂盒中检测。
3.由于只有在强碱条件下，才能让组织中的病毒破坏，从而释放核酸片段。前期为了提高灵敏度需要进行对核酸进行提取纯化，再进行等温扩增，是提取核酸和等温扩增两步同等重要，缺一不可，并且核酸的提取物以及纯化操作通常都比较复杂。这样无疑增加整个检测时间；因此，如何进一步简化操作、提高效率成了需要解决的问题。


技术实现要素：

4.为了简化操作、提高效率，本技术提供一种改性分子酶的制备方法及其分子免疫层析检测方法。
5.第一方面，本技术提供一种改性分子酶的制备方法，采用如下的技术方案：一种改性分子酶的制备方法，包括以下步骤：枯草芽孢杆菌制备，得到原生质体；将原生质体置于硫酸二乙酯(des)溶液中处理，得到待用菌溶液a；将原生质体置于紫外环境下处理，得到待用菌溶液b；将待用菌溶液a、待用菌溶液b混合，加入助溶剂共混，离心后弃去上清液，清洗后得到待筛选原生质体；将待筛选原生质体放入再生培养基中，做成ph6.0-12.0的梯度坡面培养皿，取存活原生质体；然后再将存活原生质体涂布于25-50mg/ml的庆大霉素的梯度斜面上，培养18-25天，挑选存活的菌落进行培养；从培养的菌落放到发酵培养基中进行发酵培养，得到菌液，从菌液中提取分子酶将分子酶与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)溶液、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)溶液混合，配置成分子酶溶液，分子酶溶液的浓度为20-200mg/ml；按体积份数，取15-25份edc溶液和35-45份nhs溶液，加入到分子酶溶液中反应；离心，去上清，离心得到的剩余部分用mes溶液复溶，并加入peg-聚精氨酸(poly-l-arginine)，避光反应；加入封闭液，旋转封闭反应；离心，去上清，得到改性分子酶；分子酶为μvsx酶、μvsy酶、gp32酶、bsμ酶、nfo酶、creatine kinase m-type酶中的
一种。
6.本技术是对等温扩增酶的进行改性，使其具有抗碱性以及耐热稳定性。在检测时，无需对样本进行核酸提取，在恶劣的核酸裂解环境中所使用等温扩增酶全部依旧具备很好的活性，能实现核酸的等温扩增，从而使得核酸的提取以及等温扩增可以同步反应，只需直接加入释放剂以及酶，在室温下放置5-10分钟即可完成。可以有效简化操作的步骤，缩短检测时间，提高效率。
7.具体的，对分子酶的改性主要是通过修改酶结果中的酸性氨基酸变成碱性氨基酸(精氨酸和赖氨酸)，用精氨酸取代酶表面的苯丙氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺实现的，可以达到提高酶的热稳定性的效果。
8.选用特定的edc溶液对酶进行活化，在酸性条件下，有利于提高活化反应的效率，促使酶中的-cooh(羧基)与聚精氨酸偶联。在edc溶液和nhs溶液的共同配合下，活化反应可以更加稳定进行，定向促使酶活化。
9.优选的，所述待用菌溶液a的处理包括以下步骤：取原生质体，配置成原生质体悬浮液；将des溶液与原生质体悬浮液混合，配置至des终浓度为0.7-1.0％；混合均匀后，置于35-42℃处理30-120min，得到待用菌溶液a。
10.通过采用上述技术方案，将原生质体悬浮液置于des溶液中，对其进行诱导反应，该处理方法简单、效率高，可以得到大量符合要求、具有良好抗碱效果的菌群。
11.优选的，所述待用菌溶液b的处理包括以下步骤：取原生质体配置成原生质体悬浮液；在10-25w、250-300nm的条件下对原生质体悬浮液进行紫外处理，处理时间为90-160s，避光，得到待用菌溶液b。
12.通过采用上述技术方案，在特定功率、特定波长的紫外照射下对原生质体悬浮液进处理，诱变dna使其发生特殊的改变。
13.优选的，取所述edc溶液和nhs溶液加入到分子酶溶液中反应时，edc溶液和nhs溶液的体积比为1:(2-3)。
14.通过采用上述技术方案，进一步限定edc溶液和nhs溶液之间的使用比例，提高活化酶的效率，促使目标蛋白酶可以往特定的方向进行偶联。
15.优选的，所述助溶剂为硝酸钠、聚乙二醇、二甲亚砜中的一种。
16.优选的，所述助溶剂为聚乙二醇。
17.通过采用上述技术方案，加入助溶剂促使原生质体融合。助溶剂使分离的原生质体彼此黏附，导致紧密黏着，产生融合。
18.发明人在经过多次试验之后，发现当助溶剂为聚乙二醇时，所制得改性分子酶的效果最好。
19.第二方面，本技术提供一种分子免疫层析检测方法，采用如下的技术方案：一种分子免疫层析检测方法，包括以下步骤：将1-3g待测样品加入到95-105μl核酸释放剂，在95-100℃下处理2-5min，得到待检测模板；然后将2
×
10-4-3
×
10-4
μmol/l的改性分子酶和1-2μl待检测模板混合，混合均匀后加入0.8-1.5μl激活剂，在35-40℃下反应20-45min，得到反应产物；
将反应产物用反应缓冲液稀释45-50倍，插入试剂，观察结果。
20.溶解剂为pb缓冲液，反应缓冲剂包括10mmol/l磷酸肌酸钠、0.3mg/ml bsa、3％甲酰胺、10mmol/l dtt、150μmol/l datp、150μmol/ldttp、150μmol/l dctp、150μmol/l dgtp、150μmol/l dutp，激活剂为20mm醋酸镁，反应缓冲液包括0.01mol/l tris-hcl(ph8.0)、0.85％ nacl、0.5％ tween20。
21.本方法是一种新型核酸等温扩增技术，该技术无需温度循环，通过模拟生物体内dna复制，短时间内即可完成对目的片段的核酸扩增，具有特异性高、敏感性强、反应程序简单和不依赖复杂仪器的优点。
22.具体的，在实际检测时，如果检测体系中有目标基因存在，则pcr聚合酶便会以目标基因为模板引物与之大量扩增生成两端带有生物素和羧基荧光素基团的扩增子。这些扩增子上的羧基荧光素基团能够与核酸试剂样品垫上喷涂的抗羧基荧光素抗体与胶体金复合物偶联。当试剂被插入展开缓冲液后，由于毛细作用，缓冲液会带着样品垫上的偶联物向吸收垫方向流动，当偶联物另一端的生物素基团与检测线上喷涂的链霉亲和素相结合时，扩增子与免疫胶金体的复合物便在检测线处大量沉积产生暗红色沉淀，最终呈现红色检测线的阳性结果。未结合的胶体金抗体流过t线被指控线(c线)的二抗捕获并形成可见的c线。
23.优选的，所述核酸释放剂包括以下组分：90-110mmol/ltris-hcl溶液、18-23mmol/ledta-na、0.65-0.9％ nacl溶液、0.03-0.06％ sds。
24.通过采用上述技术方案，该核酸释放剂可以维持核酸结构的稳定，同时通过使蛋白质变性、破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。
25.优选的，插入所述试剂后，在沸水水浴中进行1-3min，观察结果。
26.通过沸水水浴来加快反应的进行，提高检测效率。由于经过改性的分子酶具有良好的耐高温性，即使使用沸水处理也不会影响其活性。
27.优选的，所述改性分子酶被制成冻干粉，冻干粉与溶解剂、反应缓冲剂共同混合后，再与待检测模板混合。
28.优选的，冻干粉的反应体系为50μl，反应体系包括2.0-3.0μl上下游引物(8-12μmol/l)、25-30μl缓冲液(8-12μmol/l改性分子酶、8-12mmol/l磷酸肌酸钠)、10-15μl 6％海藻糖、6-10μl 5％甘露醇。将反应体系直接冻干，得到冻干粉。
29.优选的，所述溶解剂、反应缓冲剂的体积比例为(8-12)：(10-15)。
30.原料酶处于冻干状态时，若是溶解不好会导致效率偏低。
31.通过采用上述技术方案，进一步限定三者之间的使用比例，使原来冻干酶活性重新溶解，处于具有良好活性的状态。
32.综上所述，本技术具有以下有益效果：1、本技术是对等温扩增酶的进行改性，使其具有抗碱性以及耐热稳定性。在检测时，无需对样本进行核酸提取，在恶劣的核酸裂解环境中依旧具备很好的活性，依旧能实现核酸的等温扩增，从而使得核酸的提取以及等温扩增只需直接加入核酸释放剂以及酶，在室温下放置5-10分钟即可完成，操作简单方便。
33.2、对分子酶的改性主要是通过修改酶结果中的酸性氨基酸变成碱性氨基酸(精氨酸和赖氨酸)，用精氨酸取代酶表面的苯丙氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺实现的，可以达到提高酶的热稳定性的效果。
34.3、本方法是一种新型核酸等温扩增技术，该技术无需温度循环，通过模拟生物体内dna复制，短时间内即可完成对目的片段的核酸扩增，具有特异性高、敏感性强、反应程序简单和不依赖复杂仪器的优点。
附图说明
35.图1是样品采集部位示意图。检测样品为虾，为清楚表明采集位置，使用箭头进行标注。
36.图2是组织样品提取图。
37.图3是使用实施例1的方法所得到的检测结果图。
38.本次检测为海洋动物项目病毒检测，检测是否含有wssv病毒。
39.左边为检测结果为阴性的样品，右边为检测结果阳性的样品。
40.图4是检测结果图。位于上方的试剂纸为实施例1的检测结果，位于下方的试剂纸为对比例1的检测结果。
41.图5是检测结果图。自左向右依次为实施例1、实施例4、实施例7、对比例2、实施例5、实施例6。
具体实施方式
42.以下结合附图和实施例对本技术作进一步详细说明。
43.以下实施例及对比例中所用的原料均为市售产品。实施例
44.实施例1一种改性分子酶的制备方法，包括以下步骤：步骤a：枯草芽孢杆菌制备，得到原生质体。
45.步骤b：待用菌溶液a的处理：步骤b1)：取原生质体，配置成原生质体悬浮液；步骤b2)：将des溶液混合于原生质体悬浮液试管内，配置至des终浓度为0.9％，轻轻摇匀。
46.步骤b3)：混合均匀后，置于37℃的恒温水浴锅中保温处理60min。反应终止后，得到待用菌溶液a。
47.步骤c：待用菌溶液b的处理：步骤c1)：取原生质体，配置成原生质体悬浮液。
48.步骤c2)：将原生质体悬浮液分别倒在3个无菌培养皿中，每个无菌培养皿中有2ml原生质体悬浮液。
49.在超净工作台无可见光条件下，打开皿盖，将无菌培养皿放置在距离紫外灯30cm处。
50.调整紫外线灯功率为15w、波长为270nm，对3个无菌培养皿分别照射120s。
51.步骤c3)：照射结束后，关闭紫外灯，盖上皿盖，用黑纸将无菌培养皿包裹。得到待用菌溶液b。
52.步骤d：枯草芽孢杆菌的融合：
步骤d1)：取0.1ml的待用菌溶液a和0.1ml的待用菌溶液b，投入培养基中混合，并加入peg(聚乙二醇4000)溶液助溶，在37℃条件下保温反应30min。
53.具体的，peg溶液选用m4000、40％(w/v)的。
54.步骤d2)：将步骤d1)得到的溶液在3500r/min的条件下离心反应5min。弃去上清液，连续用培养基稳定液清洗5次。得到待筛选原生质体。
55.步骤e：将待筛选原生质体放入再生培养基中，做成ph6.0、ph8.0、ph10.0、ph12.0的梯度斜面培养皿，取存活原生质体。
56.步骤f：将存活原生质体涂布于25mg/ml、50mg/ml的庆大霉素的梯度斜面上，在37℃下培养20天。
57.培养箱内放入水盆，使箱内保持一定的湿度，防止培养基干裂。
58.步骤g：挑选存活的菌落接入斜面培养基进行培养，具体包括以下步骤：步骤g1)：制备培养基：培养基包括以下成分，详见表1。将各种原料按照用量投入到水中混合均匀即可，最终的ph为7.0
±
0.2。
59.表1成分用量l-谷氨酰胺146g/l胎牛血清10000mg/lnahc031176mg/ll-苯丙氨酸32mg/ld-葡萄糖1802mg/ll-色氨酸10mg/lhepes5958g/l青霉素g钠盐10ku/ml酚红指示剂1.2mg/l硫酸链霉素10mg/ml蛋白胨10.0g/l色素2.7g/l酵母膏粉3.0g/l琼脂12.0g/l氯化钠5.0g步骤g2)：制备发酵原料：按照大豆粉74％、mgso
4 10％、葡萄糖8％、k2hpo
4 8％、水补充至100％的使用量进行混合。
60.步骤g3)：将存活的菌落在培养基中培养一周，然后再加入发酵原料中发酵20天。
61.步骤g4)：将发酵培养后的枯草芽孢杆菌采用超声波破碎法处理，得到培养液。
62.步骤h：从培养液中提取出分子酶，进行改性。
63.分子酶为μvsx酶、μvsy酶、gp32酶、bsμ酶、nfo酶、creatine kinase m-type酶中的一种。
64.步骤i：分子酶的改性：步骤i1)：取1mg分子酶，与适量的edc溶液、nhs溶液混合，配置成分子酶浓度为
50mg/ml的分子酶溶液。
65.步骤i2)：再往分子酶溶液中加入20μl的edc溶液和40μl的nhs溶液，震荡混合反应20min。
66.步骤i3)：在4℃、15000rpm/min的条件下离心15min，去上清。
67.步骤i4)：将步骤3)中的剩余部分用0.5ml mes溶液复溶，并超声打散，同时在打散的时候加入0.1mg peg-聚精氨酸混合反应。然后避光震荡反应2h。
68.mes溶液采用50mmol/l、ph为6.5的。
69.步骤i5)：加入1ml的封闭液，旋转封闭1h。
70.封闭液采用10％peg溶液。
71.步骤i6)：在4℃、15000rpm/min的条件下离心15min，去上清，得到改性分子酶。
72.参照图1-3，本技术实施例还公开一种分子免疫层析检测方法，包括以下步骤：步骤01)：将1g待测样品加入到100μl核酸释放剂，在100℃下处理3min，得到待检测模板。
73.其中，核酸释放剂中各组分的浓度如下：100mmol/l tris-hcl、20mmol/l edta-na、0.85％nacl、0.05％sds。
74.tris-hcl采用ph为8.0的。
75.步骤02)：将改性分子酶制成冻干粉。具体的，冻干粉的反应体系为50μl，反应体系包括2.5μl上下游引物(10μmol/l)、27.5μl缓冲液(10μmol/l改性分子酶、10mmol/l磷酸肌酸钠)、10-15μl 6％海藻糖、6-10μl 5％甘露醇。将反应体系直接冻干，得到冻干粉。
76.步骤03)：将冻干粉与10μl溶解剂、12.5μl反应缓冲剂混合。
77.溶解剂为pb缓冲液，反应缓冲剂包括10mmol/l磷酸肌酸钠、0.3mg/ml bsa、3％甲酰胺、10mmol/l dtt、150μmol/l datp、150μmol/l dttp、150μmol/l dctp、150μmol/l dgtp、150μmol/l dutp。
78.步骤04)：继续往步骤03)中的溶液中加入2μl待检测模板，混合均匀后加入1.2μl激活剂，在37℃下反应30min，得到反应产物。
79.激活剂为20mmol/l醋酸镁。
80.步骤05)：将反应产物用反应缓冲液稀释50倍，插入试剂纸，观察结果。
81.反应缓冲液包括0.01mol/l tris-hcl(ph8.0)、0.85％ nacl、0.5％ tween20。
82.步骤06)：反应进行时，会看到深红色的条带在试剂纸中间的结果窗中移动。
83.步骤07)：5-10分钟内读取结果。
84.当分子酶为μvsx酶时，其改性后所得到的改性分子酶的氨基酸序列如seq id no 1所示。
85.当分子酶为μvsy酶时，其改性后所得到的改性分子酶的氨基酸序列如seq id no 2所示。
86.当分子酶为gp32酶时，其改性后所得到的改性分子酶的氨基酸序列如seq id no 3所示。
87.当分子酶为bsμ酶时，其改性后所得到的改性分子酶的氨基酸序列如seq id no 4所示。
88.当分子酶为nfo酶时，其改性后所得到的改性分子酶的氨基酸序列如seq id no 5
所示。
89.当分子酶为creatine kinase m-type酶时，其改性后所得到的改性分子酶的氨基酸序列如seq id no 6所示。
90.关于检测结果的解释：阳性：结果窗出现两条红色线，即在检测区(t)及质控区(c)各出现一条红色反应线，说明病毒是存在。
91.阴性：一条红色线，即仅在质控区(c)出现一条红色反应线。
92.无效：质控区(c)无红色线出现，即检测无效。
93.试验证明，使用该改性分子酶进行的分子免疫层析检测方法可以出现阳性或阴性的结果，检测结果100％稳定出现。
94.目测试剂纸上的检测结果，反应线清晰出现，可达10分(满分10分)。
95.具体结果详见图3、4。
96.实施例2一种改性分子酶的制备方法，与实施例1的不同之处在于，步骤b2)中至des终浓度为1.0％。
97.步骤b3)的处理条件为42℃、30min。
98.步骤c2)的处理条件为25w、300nm，处理90s。
99.步骤f)中培养18天。
100.一种分子免疫层析检测方法，与实施例1的不同之处在于，核酸释放剂中各组分的浓度如下：110mmol/l tris-hcl、23mmol/l edta-na、0.9％nacl、0.03％sds。
101.步骤03)中将冻干粉与8μl溶解剂、10μl反应缓冲剂混合。
102.步骤04)中待检测模板的使用量为2μl，激活剂的使用量为1.5μl，在40℃下反应20min。
103.试验证明，使用该改性分子酶进行的分子免疫层析检测方法可以出现阳性或阴性的结果，检测结果85％稳定出现。
104.目测试剂纸上的检测结果，反应线出现较为清晰，可达7分(满分10分)。
105.实施例3一种改性分子酶的制备方法，与实施例1的不同之处在于，步骤b2)中至des终浓度为0.7％。
106.步骤b3)的处理条件为35℃、120min。
107.步骤c2)的处理条件为10w、250nm，处理160s。
108.步骤f)中培养25天。
109.一种分子免疫层析检测方法，与实施例1的不同之处在于，核酸释放剂中各组分的浓度如下：90mmol/l tris-hcl、18mmol/l edta-na、0.65％nacl、0.06％sds。
110.步骤03)中将冻干粉与12μl溶解剂、15μl反应缓冲剂混合。
111.步骤04)中待检测模板的使用量为1μl，激活剂的使用量为0.8μl，在35℃下反应45min。
112.步骤05)中稀释至45倍。
113.试验证明，使用该改性分子酶进行的分子免疫层析检测方法可以出现阳性或阴性的结果，检测结果90％稳定出现。
114.目测试剂纸上的检测结果，反应线出现较为清晰，可达7分(满分10分)。
115.实施例4一种改性分子酶的制备方法，与实施例1的不同之处在于，步骤i2)中edc溶液为25μl，nhs溶液为35μl。
116.试验证明，使用该改性分子酶进行的分子免疫层析检测方法可以出现阳性或阴性的结果，检测结果100％稳定出现。
117.目测试剂纸上的检测结果，反应线出现较为清晰，可达8分(满分10分)。
118.具体检测结果详见图5。
119.实施例5一种改性分子酶的制备方法，与实施例1的不同之处在于，步骤i2)中edc溶液为15μl，nhs溶液为45μl。
120.试验证明，使用该改性分子酶进行的分子免疫层析检测方法可以出现阳性或阴性的结果，检测结果100％稳定出现。
121.目测试剂纸上的检测结果，反应线出现较为清晰，可达8.5分(满分10分)。
122.具体检测结果详见图5。
123.实施例6一种分子免疫层析检测方法，与实施例1的不同之处在于，步骤03)：将冻干粉与5μl溶解剂、25μl反应缓冲剂混合。
124.试验证明，使用该改性分子酶进行的分子免疫层析检测方法可以出现阳性或阴性的结果，检测结果95％稳定出现。
125.目测试剂纸上的检测结果，反应线出现较为清晰，可达8分(满分10分)。
126.具体检测结果详见图5。
127.实施例7一种分子免疫层析检测方法，与实施例1的不同之处在于，步骤04)插入试剂纸后，在沸水水浴中进行3min，观察结果。
128.试验证明，使用该改性分子酶进行的分子免疫层析检测方法可以出现阳性或阴性的结果，检测结果100％稳定出现。
129.目测试剂纸上的检测结果，反应线快速、清晰出现，可达10分(满分10分)。
130.具体检测结果详见图5。
131.对比例对比例1一种分子免疫层析检测方法，与实施例1的不同之处在于，将步骤02)中的改性分子酶替换为市售的分子酶。
132.试验证明，使用该改性分子酶进行的分子免疫层析检测方法无法出现阳性或阴性的结果。
133.具体结果详见图4，质控区(c)无红色线出现，检测无效。
134.对比例2一种改性分子酶的制备方法，与实施例1的不同之处在于，步骤i2)中，edc溶液和nhs溶液的体积比为1：1，即edc溶液为20μl，nhs溶液为20μl。
135.试验证明，使用该改性分子酶进行的分子免疫层析检测方法出现阳性或阴性的结果不稳定，仅有50％的试剂纸可出现结果。
136.目测试剂纸上的检测结果，反应线较模糊，可达4分(满分10分)。
137.具体检测结果详见图5。
138.对比例3一种改性分子酶的制备方法，与实施例1的不同之处在于，省略步骤b。
139.试验证明，使用该改性分子酶进行的分子免疫层析检测方法无法出现阳性或阴性的结果，质控区(c)无红色线出现，检测无效。
140.对比例4一种改性分子酶的制备方法，与实施例1的不同之处在于，省略步骤c。
141.试验证明，使用该改性分子酶进行的分子免疫层析检测方法无法出现阳性或阴性的结果，质控区(c)无红色线出现，检测无效。
142.本具体实施例仅仅是对本技术的解释，其并不是对本技术的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本技术的权利要求范围内都受到专利法的保护。