一种胆汁酸-甲硝唑缀合物及其应用

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及一种胆汁酸-甲硝唑缀合物及其应用。


背景技术：

2.硝唑类化合物是一类可用于治疗或预防厌氧菌引起的系统或局部感染的抗生素，主要包括甲硝唑、奥硝唑、替硝唑和塞克硝唑等，已经广泛的在临床使用。甲硝唑作为临床使用的一线药物，成人使用剂量约在1.2-2.5g/d，使用剂量较大，约15％～30％病例会出现不良反应，如恶心、呕吐、头痛、眩晕等，严重时可致抽搐等。停药后不良反应会逐步恢复。肝、肾功能不全者需要降低剂量。为了改善甲硝唑的临床使用，已经开发了人工牛黄甲硝唑复方制剂，应用于急性智齿冠周炎，牙髓炎、根尖周炎等。也有将甲硝唑开发成前药形式，如苯酰甲硝唑、甲硝唑磷酸酯或者其二钠盐、甲硝唑乙酸酯、甲硝唑丁酯、甲硝唑油酸酯、甲硝唑棕榈酸酯等来改善甲硝唑的药学及其药效学特征。
3.胆汁酸类化合物是一类结构类似、一般含有24个碳原子的四环稠环甾体化合物，具有调节肠道菌群和抗感染的作用。近年来，有文献表明，次级胆汁酸对艰难梭菌的生长具有一定的调控作用(y.sato,k.atarashi,d.r.plichta,etal, novelbileacidbiosyntheticpathwaysareenrichedinthemicrobiomeofcentenarians, nature,2021,599,458-464；b.h.mullish,j.r.allegretti,thecontributionofbileacidmetabolismtothepathogenesisofclostridioidesdifficileinfection,therapeuticadvancesingastroenterology,2021,14,1-12.)，如熊去氧胆酸(udca，ursodeoxycholicacid)能够通过改变肠道胆汁酸减轻炎症(j.a.winston,a.j. rivera,j.cai,etal,ursodeoxycholicacid(udca)mitigatesthehostinflammatoryresponseduringclostridioidesdifficileinfectionbyalteringgutbileacids，infectionandimmunity,2020,88,e00045-20)。
4.甲硝唑以其良好的药效学特点被用于腹部复杂性感染；同时也被美国胃肠病学会推荐用于治疗轻、中度艰难梭菌感染的初次发病患者。虽然抗生素可以治疗急性感染，但也会使肠道菌群失调恶化，使患者更容易复发感染并形成恶性循环。考虑到细菌在进化过程中的耐药性会逐渐增加，且临床已经观察到耐甲硝唑和耐万古霉素的难治菌株出现，因此，开发具有高活性的、抑制艰难梭菌的新机理或新结构的抑菌剂刻不容缓。


技术实现要素：

5.针对以上技术缺陷，本发明实施例提供了一种新型的胆汁酸-甲硝唑缀合物，旨在制备一种新型抗生素药物，以提升甲硝唑的药效性，用于治疗或抑制厌氧菌感染(包括艰难梭菌感染)。
6.本发明实施例公开了一种胆汁酸-甲硝唑缀合物，所述缀合物具有如式(i)所示的化学结构、或其立体异构体、或其盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物；
[0007][0008]
其中，代表单键或双键，代表-h、-oh、＝o中的一种。
[0009]
所述缀合物、或其立体异构体、或其盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物选自以下结构：
[0010][0011]
所述胆汁酸-甲硝唑缀合物通过胆汁酸类化合物与甲硝唑发生酯化反应而制得。
[0012]
其中，所述胆汁酸类化合物选自胆酸、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸、别鹅去氧胆酸、猪脱氧胆酸、猪胆酸、石胆酸及它们的衍生物中的一种。
[0013]
一种胆汁酸-甲硝唑缀合物的应用，所述胆汁酸-甲硝唑缀合物应用于抑制厌氧细菌的生长。
[0014]
其中，所述厌氧细菌包括但不限于艰难梭菌、脆弱拟杆菌、牙龈卟啉单胞菌、产黑普氏菌。
[0015]
本发明提供的一种胆汁酸-甲硝唑缀合物，所述缀合物、或其立体异构体、或其盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物，所述胆汁酸-甲硝唑缀合物采用胆酸类化合物与甲硝唑结构上的羟基成酯反应制备，合成工艺简单，易于产业化。所述胆汁酸-甲硝唑缀合物能够有效抑制厌氧菌的生长，特别是能够抑制艰难梭菌的生长，所述胆汁酸-甲硝唑缀合物在厌氧菌感染治疗上的治疗效果有所提高。
具体实施方式
[0016]
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0017]
本发明实施例中各原料介绍：
[0018]
盐酸，购于国药集团化学试剂有限公司，cas号为7647-01-0；
[0019]
碳酸氢钠，购于国药集团化学试剂有限公司，cas号为144-55-8；
[0020]
无水硫酸钠，购于国药集团化学试剂有限公司，cas号为7757-82-6；
[0021]
石胆酸，购于中山百灵生物技术有限公司，cas号为434-13-9；
[0022]
甲硝唑，购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，cas号为443-48-1；
[0023]
1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐，购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，cas号为25952-53-8；
[0024]
二甲氨基吡啶，购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，cas号为5683-33-0；
[0025]
二氯甲烷，购于国药集团化学试剂有限公司，cas号为75-09-2；
[0026]
石油醚，购于国药集团化学试剂有限公司，cas号为8032-32-4；
[0027]
乙酸乙酯，购于国药集团化学试剂有限公司，cas号为141-78-6；
[0028]
熊去氧胆酸，购于中山百灵生物技术有限公司，cas号为128-13-2；
[0029]
鹅去氧胆酸，购于中山百灵生物技术有限公司，cas号为474-25-9；
[0030]
别鹅去氧胆酸，购于中山百灵生物技术有限公司，cas号为15357-34-3；
[0031]
猪脱氧胆酸，购于中山百灵生物技术有限公司，cas号为83-49-8；
[0032]
猪胆酸，购于中山百灵生物技术有限公司，cas号为547-75-1；
[0033]
胆酸，购于中山百灵生物技术有限公司，cas号为81-25-4；
[0034]
应当理解，当在本说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括”和“包含”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素、组件和/或其集合的存在或添加。
[0035]
还应当理解，在本发明说明书中所使用的术语仅仅是出于描述特定实施例的目的而并不意在限制本发明。如在本发明说明书和所附权利要求书中所使用的那样，除非上下文清楚地指明其它情况，否则单数形式的“一”、“一个”及“该”意在包括复数形式。
[0036]
还应当进一步理解，在本发明说明书和所附权利要求书中使用的术语“和/ 或”是指相关联列出的项中的一个或多个的任何组合以及所有可能组合，并且包括这些组合。
[0037]
本发明实施例公开了一种胆汁酸-甲硝唑缀合物，所述缀合物具有式(i)所示的化学结构、或其立体异构体、或其盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物；
[0038][0039]
其中，代表单键或双键，代表-h、-oh、＝o中的一种。
[0040]
所述缀合物、或其立体异构体、或其盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物选自以下结构：
[0041][0042][0043]
其中，所述胆汁酸类化合物选自胆酸、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸、别鹅去氧胆酸、猪脱氧胆酸、石胆酸及它们的衍生物中的一种。
[0044]
一种胆汁酸-甲硝唑缀合物的应用，所述胆汁酸-甲硝唑缀合物应用于抑制厌氧细菌的生长。
[0045]
其中，所述厌氧细菌包括但不限于艰难梭菌、脆弱拟杆菌、牙龈卟啉单胞菌、产黑普氏菌。
[0046]
所述胆汁酸-甲硝唑缀合物还能够预防艰难梭菌感染性疾病、艰难梭菌感染性疾病的复发或艰难梭菌感染性疾病并发症。
[0047]
实施例1：化合物scut1-1的合成：
[0048][0049]
在100毫升单口瓶中加入1.01g石胆酸(lca，lithocholicacid)、0.54g 甲硝唑、0.75g1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐，0.48g二甲氨基吡啶和50ml二氯甲烷，室温搅拌5-6小时，tlc监控反应进度直至lca反应完全，将反应液倒入250ml分液漏斗，加入50ml水以及10ml稀盐酸(1m)，萃取分出有机相，向有机相再次加入50ml水和10ml稀盐酸(1m)，洗涤分出有机相，然后向有机相加入100ml饱和碳酸氢钠溶液，洗涤分出有机相，向有机相加入无水硫酸钠(5.0g)干燥，过滤除去固体，滤液真空浓缩，残余物用硅胶柱层析，石油醚/乙酸乙酯(v/v＝1:3)体系为洗脱液，蒸除溶剂后得白色固体0.81克。
[0050]1hnmr(600mhz,cdcl3)δ7.96(s,1h),4.59(t,j＝5.3hz,2h),4.41(m, 2h),3.62(m,1h),2.52(s,3h),2.30(ddd,j＝15.6,10.4,5.2hz,1h),2.17(ddd,j＝ 15.9,10.0,6.4hz,1h),1.94(dt,j＝12.3,3.2hz,1h),1.88
–
1.62(m,8h),1.60
ꢀ–
1.48(m,2h),1.44
–
1.37(m,5h),1.37
–
1.31(m,2h),1.31
–
1.18(m, 5h),1.13(td,j＝12.8,3.6hz,1h),1.10
–
1.00(m,4h),0.97(td,j＝14.2,3.5hz, 1h),0.92(s,3h),0.88(d,j＝6.5hz,3h),0.63(s,3h)；
[0051]
13
cnmr(151mhz,cdcl3)δ173.61,150.80,138.55,133.13,71.85,62.36, 56.47,55.82,45.09,42.74,42.08,40.42,40.14,36.46,35.84,35.35,35.29,34.57, 30.93,30.78,30.55,28.19,27.18,26.41,24.19,23.37,20.81,18.24,14.39,12.04；
[0052]
hrms-esi(m/z):c
30h47
n3o5测定值：530.3581[m+h]
+
，552.3405[m+ na]
+
。
[0053]
实施例2：化合物scut1-2的合成：
[0054][0055]
使用熊去氧胆酸(udca，ursodeoxycholicacid)替代lca为反应物，采用与实施例1相同的方法合成scut1-2。
[0056]1hnmr(600mhz,cdcl3)δ7.96(s,1h),4.59(t,j＝5.3hz,2h),4.45
–ꢀ
4.36(m,2h),3.59(m,2h),2.52(s,3h),2.31(ddd,j＝15.6,10.3,5.2hz,1h),2.17 (ddd,j＝16.0,10.0,6.3hz,1h),1.98(dt,j＝12.5,3.3hz,1h),1.91
–
1.76(m, 5h),1.73(m,2h),1.69
–
1.65(m,3h),1.62
–
1.55(m,3h),1.52
–
1.35(m, 7h),1.32
–
1.20(m,6h),1.14(td,j＝12.9,3.9hz,1h),1.07
–
0.99(m,2h), 0.95(s,3h),0.90(d,j＝6.5hz,3h),0.66(s,3h)；
[0057]
13
cnmr(151mhz,cdcl3)δ173.55,150.78,133.09,71.45,71.37,62.37, 55.69,54.78,45.07,43.78,43.76,42.44,40.10,39.17,37.30,36.88,35.18,34.93, 34.08,30.92,30.79,30.35,28.59,26.87,23.38,21.16,18.36,14.38,12.13；
[0058]
hrms-esi(m/z):c
30h47
n3o6测定值：546.3535[m+h]
+
，568.3352[m+ na]
+
。
[0059]
实施例3：化合物scut1-3的合成：
[0060][0061]
使用鹅去氧胆酸(cdca，chenodeoxycholicacid)替代lca为反应物，采用与实施例1相同的方法合成scut1-3。
[0062]1hnmr(600mhz,cdcl3)δ7.96(s,1h),4.59(t,j＝5.3hz,2h),4.41(td, j＝5.3,2.9hz,2h),3.85(q,j＝3.1hz,1h),3.47(tt,j＝10.9,4.4hz,1h),2.52(s, 3h),2.30(ddd,j＝15.5,10.2,5.1hz,1h),2.23
–
2.15(m,2h),1.97(m,3h),1.84 (m,4h),1.75
–
1.60(m,8h),1.50
–
1.48(m,2h),1.42
–
1.25(m,12h),1.15 (m,4h),0.98(td,j＝14.2,3.2hz,2h),0.90(d,j＝7.3hz,6h),0.65(s,3h)；
[0063]
13
cnmr(151mhz,cdcl3)δ173.57,150.79,133.13,72.02,68.53,62.38, 55.61,50.45,45.09,42.70,41.47,39.91,39.60,39.42,35.32,35.27,35.05,34.63, 32.83,30.83,30.74,30.68,29.71,28.15,23.70,22.77,20.57,18.24,14.41,11.78；
[0064]
hrms-esi(m/z):c
30h47
n3o6测定值：546.3536[m+h]
+
，568.3350[m+ na]
+
。
[0065]
实施例4：化合物scut1-4的合成：
[0066][0067]
采用别鹅去氧胆酸(acdca，allo-chenodeoxycholicacid)替代lca为反应物，采用与实施例1相同的方法合成scut1-4。
[0068]1hnmr(600mhz,cdcl3)δ7.96(s,1h),4.59(t,j＝5.3hz,2h),4.41(td, j＝5.5,2.8hz,2h),4.05(q,j＝2.9hz,1h),3.83(t,j＝3.0hz,1h),2.52(s,3h), 2.30(ddd,j＝15.6,10.3,5.2hz,1h),2.17(ddd,j＝15.9,9.9,6.4hz,1h),2.04(tt,j＝13.0,3.5hz,1h),1.92(dt,j＝12.9,3.2hz,1h),1.84(m,2h),1.76
–
1.61(m, 8h),1.59
–
1.48(m,4h),1.48
–
1.41(m,3h),1.37(m,6h),1.28(m,7h),1.11 (m,4h),0.89(d,j＝6.5hz,3h),0.78(s,3h),0.64(s,3h)；
[0069]
13
cnmr(151mhz,cdcl3)δ173.59,150.81,138.47,133.14,67.99,66.44, 62.38,55.58,50.62,45.87,45.09,42.65,39.50,39.45,36.30,36.19,35.58,35.27, 31.95,31.59,30.83,30.74,28.85,28.07,23.56,20.53,18.23,14.40,11.86,10.13；
[0070]
hrms-esi(m/z):c
30h47
n3o6测定值：546.3532[m+h]
+
，568.3356[m+ na]
+
。
[0071]
实施例5：化合物scut1-5的合成：
[0072][0073]
采用猪脱氧胆酸(hdca，hyodeoxycholicacid)替代lca为反应物，采用与实施例1相同的方法合成scut1-5。
[0074]1hnmr(600mhz,cdcl3)δ7.96(s,1h),4.59(t,j＝5.3hz,2h),4.41(q,j＝5.1hz,2h),4.05(dt,j＝12.1,4.8hz,1h),3.62(tt,j＝10.7,4.6hz,1h),2.52(s, 3h),2.31(ddd,j＝15.6,10.3,5.2hz,1h),2.17(ddd,j＝16.0,10.0,6.4hz,1h), 1.98
–
1.92(m,2h),1.87
–
1.75(m,3h),1.75
–
1.55(m,6h),1.48
–
1.02 (m,18h),0.90(s,3h),0.88(d,j＝6.5hz,3h),0.63(s,3h)；
[0075]
13
cnmr(151mhz,cdcl3)δ173.57,150.80,138.55,133.05,71.57,68.04, 62.37,56.11,55.78,48.39,45.08,42.85,39.91,39.80,35.95,35.56,35.26,35.00, 34.82,30.91,30.72,30.23,29.19,28.10,24.17,23.48,20.74,18.22,14.36,12.02；
[0076]
hrms-esi(m/z):c
30h47
n3o6测定值：546.3529[m+h]
+
，568.3361[m+ na]
+
。
[0077]
实施例6：化合物scut1-6的合成：
[0078][0079]
采用猪胆酸(hca，hyocholicacid)替代lca为反应物，采用与实施例1 相同的方法合成scut1-6。
[0080]1hnmr(600mhz,meoh-d4)δ7.93(s,1h),4.67(t,j＝5.2hz,2h),4.47
ꢀ–
4.39(m,2h),3.79
–
3.75(m,2h),3.37
–
3.32(m,1h),2.52(s,3h),2.31 (ddd,j＝15.2,9.7,5.3hz,1h),2.18(ddd,j＝15.9,9.5,6.9hz,1h),1.98(td,j＝7.0, 4.1hz,2h),1.95
–
1.66(m,7h),1.62(dt,j＝12.1,3.3hz,1h),1.58
–
1.47(m, 4h),1.39
–
1.00(m,12h),0.92(s,3h),0.90(d,j＝6.6hz,3h),0.66(s,3h)；
[0081]
13
cnmr(151mhz,meoh-d4)δ175.10,152.59,132.68,72.94,72.84, 70.77,63.44,57.21,51.40,49.57,46.25,43.79,40.95,40.09,37.07,36.85,36.68, 33.97,33.37,32.08,31.80,31.43,29.21,24.55,23.73,21.81,18.76,14.14,12.20；
[0082]
hrms-esi(m/z):c
30h47
n3o7测定值：584.3308[m+na]
+
。
[0083]
实施例7：化合物scut1-7的合成：
[0084][0085]
采用胆酸(ca，cholicacid)替代lca为反应物，采用与实施例1相同的方法合成scut1-7。
[0086]1hnmr(600mhz,meoh-d4)δ7.84(s,1h),4.57(t,j＝5.2hz,2h),4.33 (m,2h),3.83(d,j＝3.0hz,1h),3.70(q,j＝3.0hz,1h),3.27(tt,j＝11.2,4.4hz, 1h),2.42(s,3h),2.16
–
2.06(m,2h),1.92
–
1.83(m,2h),1.77
–
1.73(m, 1h),1.71(dt,j＝13.7,3.4hz,2h),1.66
–
1.57(m,2h),1.51
–
1.41(m,5h), 1.37
–
1.12(m,7h),1.00(m,1h),0.86(d,j＝6.5hz,3h),0.82(s,3h),0.59(s, 3h)；
[0087]
13
cnmr(151mhz,meoh-d4)δ173.72,151.16,131.23,72.56,71.48, 67.63,61.98,46.47,46.07,44.83,41.81,41.58,39.62,39.07,35.21,35.09,34.50, 34.44,30.63,30.31,29.78,28.18,27.22,26.48,22.79,21.75,16.15,12.70,11.56；
[0088]
hrms-esi(m/z):c
30h47
n3o7测定值：584.3304[m+na]
+
。
[0089]
实施例8：化合物scut1-8的合成：
[0090][0091]
采用7-羰基石胆酸(7keto-ca)替代lca为反应物，采用与实施例1相同的方法合成scut1-8。
[0092]1hnmr(600mhz,cdcl3)δ8.05
–
8.01(m,1h),4.68
–
4.58(m,2h), 4.43(m,2h),3.97(d,j＝3.0hz,1h),3.59(td,j＝10.9,5.3hz,1h),2.83(dd,j＝ 12.6,6.0hz,1h),2.59(s,3h),2.43
–
2.06(m,11h),1.98
–
1.95(m,1h),1.95
ꢀ–
1.89(m,2h),1.89
–
1.86(m,1h),1.86
–
1.73(m,3h),1.74
–
1.62(m, 5h),1.56(dt,j＝14.3,3.7hz,1h),1.40
–
1.13(m,17h),1.00
–
0.83(m,6h), 0.66(s,3h)；
[0093]
13
cnmr(151mhz,cdcl3)δ211.57,173.51,131.80,107.14,71.95,70.89, 62.30,49.51,46.49,46.05,45.36,40.69,37.42,35.98,34.84,34.71,34.12,30.66, 30.55,29.79,29.71,29.31,27.60,24.26,22.82,17.35,14.19,12.82；
[0094]
hrms-esi(m/z):c
30h45
n3o7测定值：560.3326[m+h]
+
，582.3141[m+ na]
+
。
[0095]
以下通过实验例证明本发明化合物的有益效果。
[0096]
实验例1、本发明化合物对厌氧菌体外抑制活性
[0097]
(一)实验方法
[0098]
分别选用实验菌株：艰难梭菌atcc43255、脆弱拟杆菌atcc25285、牙龈卟啉单胞菌
atcc33277、产黑普氏菌atcc25845。
[0099]
实验过程：
[0100]
s1、分别制备或准备环丝氨酸-头孢西丁-果糖琼脂培养基、胰蛋白胨大豆肉汤培养基、脑心浸液肉汤培养基、强化布氏肉汤培养基、哥伦比亚血琼脂平板、厌氧血琼脂平板；
[0101]
其中，环丝氨酸-头孢西丁-果糖琼脂培养基配制：称取环丝氨酸-头孢西丁
‑ꢀ
果糖琼脂培养基53.2g，加热溶解于1l蒸馏水中，分装于锥形瓶中，121℃高压灭菌15分钟。每200ml中加入无菌环丝氨酸0.10g和无菌头孢西丁3.20mg (滤膜过滤除菌)混匀，倒入无菌平皿，备用。
[0102]
胰蛋白胨大豆肉汤培养基配制：称取胰蛋白胨大豆肉汤培养基干粉30.0g，加热溶解于1l蒸馏水中，分装于锥形瓶中，121℃高压灭菌15分钟。
[0103]
脑心浸液肉汤培养基配制：称取脑心浸液肉汤培养基37.0g，溶于1l蒸馏水，分装于锥形瓶中，121℃高压灭菌15分钟。
[0104]
强化布氏肉汤培养基配制：分别配置5mg/ml的氯化血红素溶液、4mg/l 的氢氧化钠溶液及维生素k1溶液；称取布氏肉汤干粉培养基28.1g，溶于900ml 蒸馏水，添加布氏琼脂粉28.0g，氯化血红素溶液1ml，维生素k1工作液1ml， 121℃高压灭菌15分钟。冷却肉汤到48-50℃后加入100ml无菌的溶解马血 (50％)。
[0105]
具体的，氯化血红素溶液(5mg/ml)的配置方法为：溶解0.10g氯化血红素于2mlnaoh溶液(4mg/l)，加入蒸馏水至20ml，121℃高压灭菌15分钟， 4-8℃保存，避光。
[0106]
具体的，氢氧化钠(4mg/l)的配置方法为：溶解40.0g氢氧化钠于1l蒸馏水，室温保存。
[0107]
具体的，维生素k1溶液的配置方法为：加0.20ml维生素k1于20ml95％的乙醇中，配置为10mg/ml的贮存液，黑色瓶存储于4-8℃。加1ml贮存液于 9ml灭菌蒸馏水中，制备为1mg/ml工作液，黑色瓶存储于4-8℃。
[0108]
其中，哥伦比亚血琼脂平板及厌氧血琼脂平板均购买成品培养基。
[0109]
s2、化合物母液配制及稀释：取胆汁酸-甲硝唑缀合物用100％dmso为溶剂进行溶解配制，母液浓度1600μg/ml，测试浓度为32-0.06μg/ml，用无菌水稀释，共10个两倍稀释浓度；
[0110]
s3、艰难梭菌菌株培养：1)-80℃存放的菌株用环丝氨酸-头孢西丁-果糖琼脂培养基平板在厌氧手套箱中进行复苏，37℃静置于恒温培养箱中培养48小时；
[0111]
2)挑单菌落在脑心浸液肉汤培养基中37℃静置于恒温培养箱中过夜培养；
[0112]
3)静置培养一夜的菌液按1:100的比例用脑心浸液肉汤培养基在厌氧手套箱中进行转接，培养3-4小时至od600处于0.6-0.8之间，此过程中添加5g/l 的酵母提取物溶液增加菌株浓度。
[0113]
s4、脆弱拟杆菌菌株培养：
[0114]
1)-80℃存放的菌株用厌氧血琼脂平板在厌氧手套箱中进行复苏，37℃静置于恒温培养箱中培养48小时；
[0115]
2)挑单菌落在胰蛋白胨大豆肉汤培养基中37℃静置过夜培养，肉眼可见透亮培养基内出现均匀浑浊。
[0116]
s5、牙龈卟啉单胞菌、产黑普氏菌菌株培养：
[0117]-80℃存放的菌株用哥伦比亚血琼脂平板在厌氧手套箱中进行复苏，37℃静置于恒温培养箱中培养5-7天；
[0118]
挑单菌落在脑心浸液肉汤培养基中37℃静置培养2-3天，肉眼可见透亮培养基内出现均匀浑浊。
[0119]
菌株的培养过程厌氧手套箱中操作，操作完成后使用厌氧袋或厌氧盒将其封好，取出后置于恒温培养箱中培养。
[0120]
s6、使用微量稀释肉汤法进行mic测定：
[0121]
1)菌液稀释：用浊度仪将菌液浊度调节至od
600
＝0.1，然后用培养基按照1:15进行稀释达到浓度1
×
107cfu/ml，接种10μl菌悬液到96微孔板中，使得细菌最终试验浓度为1
×
106cfu/ml。
[0122]
2)试验孔每孔接种0.1ml稀释后的化合物溶液，10μl调整过浓度的菌悬液。
[0123]
3)板上设置不加药对照组(100μl培养基+10μl调整过浓度的菌悬液)，空白对照(110μl培养基)。
[0124]
4)接种完成的微孔板置于厌氧盒密封，37℃培养48小时，测定光密度，计算抑菌活性，并计算细菌不生长或生长最显著减少时的药物浓度即为mic值。
[0125]
(二)实验结果：
[0126]
表1本发明化合物抑制艰难梭菌菌体活性mic值(μg/ml)
[0127][0128]
从表1可以看出胆汁酸-甲硝唑缀合物scut1-8对艰难梭菌(atcc43255)、脆弱拟杆菌(atcc25285)、牙龈卟啉单胞菌(atcc33277)、产黑普氏菌(atcc 25845)均表现出较好的抑菌性，其中胆汁酸-甲硝唑缀合物scut1-2、scut1-3、 scut1-6对艰难梭菌(atcc43255)的抑制作用尤为突出。相同使用剂量下，胆汁酸-甲硝唑缀合物scut1-8对艰难梭菌(atcc43255)、脆弱拟杆菌(atcc 25285)、牙龈卟啉单胞菌(atcc33277)、产黑普氏菌
(atcc25845)的抑制活性明显高于胆汁酸类化合物的抑制活性。相同使用剂量下，胆汁酸-甲硝唑缀合物scut1-8对艰难梭菌(atcc43255)、脆弱拟杆菌(atcc25285)、牙龈卟啉单胞菌(atcc33277)、产黑普氏菌(atcc25845)的抑制活性明显高于甲硝唑的抑制活性，部分化合物(如scut1-6)的对艰难梭菌的抑制活性提升了50多倍，部分化合物(如scut1-4)对产黑普氏菌的抑制活性提升了近 16倍，大部分化合物都有效提升了对牙龈卟啉单胞菌的抑制活性，能够很好的抑制厌氧菌的生长。
[0129]
综上，本发明提供的一种胆汁酸-甲硝唑缀合物，能够有效抑制艰难梭菌 (atcc43255)、脆弱拟杆菌(atcc25285)、牙龈卟啉单胞菌(atcc33277)、产黑普氏菌(atcc25845)菌体的生长，具有显著的抑菌活性，在生物医药领域具有较好的应用前景。
[0130]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。